抗菌药物跨生物膜传递方式的研究进展

冯梦蝶(综述)　曾韦锟,2△(审校)

(1昆明理工大学医学院医学微生物学教研室　昆明　650500;2昆明学院医学院临床检验教研室　昆明　650214)

抗菌药物跨生物膜传递方式的研究进展

冯梦蝶1(综述)曾韦锟1,2△(审校)

(1昆明理工大学医学院医学微生物学教研室昆明650500;2昆明学院医学院临床检验教研室昆明650214)

【摘要】生物膜是指单一或混合微生物附着于生物或者合成的表面具有一定组织结构的微生物聚集体,其组成成分包括微生物自身及其分泌的多糖基质、纤维蛋白及脂质蛋白。生物膜除了能够帮助细菌耐受多种环境压力,例如紫外线、噬菌体等,更为重要的是它能够阻碍抗生素进入和扩散,是病原菌耐药性形成的重要机制之一。因此,在治疗病原体感染的过程中,选择一种有效的抗菌药物是必要的,但对于形成生物膜的微生物如何将抗菌药物有效地传递至生物膜从而彻底治愈成膜病原菌感染是至关重要的,所以本文就抗菌药物传递至生物膜的运输方式进行综述。

【关键词】抗菌药物;生物膜;药物传递方式

生物膜是指附着于表面具有一定组织结构的微生物聚集体。生物膜的组成包括微生物自身及其分泌的多糖基质、纤维蛋白及脂质蛋白。生物膜依附的表面包括肺组织、心脏瓣膜、骨骼、伤口和医疗设备等[1]。在微生物的生命活动中,促使生物膜形成有4个主要的原因[2]:(1)抵抗外界不利环境;(2)在富营养环境中优先生存;(3)有利于群体之间的相互联系;(4)对于某些微生物而言,生物膜的形成是一种正常的增殖过程。一旦微生物大量形成生物膜,即使是使用高效的抗生素,也很难根除[3]。生物膜不仅能够改变单个微生物基因表达和生理特性,并且还具有独特的结构、生物化学和微环境,它能够阻碍抗生素的进入和扩散,从而耐受高浓度的抗生素。临床统计表明,大约80%的细菌感染与生物膜相关,在临床生物膜已成为病原菌耐药性形成的重要机制之一,加大了治疗难度,传统的抗生素治疗生物膜感染经常会由于根治不了生物膜导致再次感染[4]。所以,要想根治细菌感染,如何将抗菌药进行有效地传递至生物膜才是关键。

许多潜在有价值的治疗药物由于其较差的生物制药属性使它们的使用受到限制,药物的毒性、溶解度、生物分布和稳定性可能会影响积累以及药物在体内的活性,而药物传递系统可以增强药物的性能、改善靶标(抗体)以及应对周围环境刺激(pH和温度)和其他物理特性(大小、离子强度、溶解度和降解),从而有利于药物靶向治疗[5]。跨生物膜传递系统主要通过药物传递物质表面的改性增加抗菌药物的吸附能力、药物传递系统携带药物的可控逐步释放提高药物的利用率、增加生物膜微环境的渗透压直接穿透生物膜和抑制生物膜形成相关蛋白的合成[6]等过程帮助药物传递至生物膜,杀死生物膜病原菌,治愈病原菌感染。本文针对抗菌药物跨生物膜传递系统进行分述。

脂质药物运载系统脂质药物运载系统(lipid-based drug delivery systems,LBDDS)是一种新型技术,能够减少药物的毒性并改变药物的生物分布远离敏感器官,同时能够提高水溶性药物的可溶性而提高药物可用率[7]。关于LBDDS种类有很多种,其中脂质体、固体脂质纳米颗粒和微乳液与生物膜具有很强的相似相溶性,故而广泛地用于抗菌药物生物膜传递系统中。

脂质体脂质体是自组装的脂质双分子层,水合时形成球形囊泡,由各种各样的磷酸、类脂以及甾醇、糖脂、膜蛋白和亲水性聚合物组成[8]。在脂质双层中加入特定细胞具有选择性与亲和性的配体,利用细胞受体和配体之间特异性识别作用实现靶向释放药物。

脂质载体实现跨生物膜传递的机制是脂质体成分不同,阴阳离子脂质体成分不同对形成生物膜的微生物的吸附能力不同,吸附力强,吸附的脂质体多,携带的抗菌药物就多,对生物膜的杀伤力大,从而具有更好的抗菌效果。研究证明脂质体成分是影响其吸附于混合生物膜细菌的主要因素[9]。携带疏水性杀菌剂三氯生的阳离子脂质体和阴离子脂质体分别与柠檬酸锌颗粒结合形成的固体脂质体对生物膜中口腔链球菌的吸附是有很大差异的,主要原因是因为阴离子脂质体制剂与口腔链球菌的吸附是羟基静电引力和氢键相关静电排斥力之间的平衡,而阳离子脂质体制剂与菌相互作用仅仅决定于静电引力[10]。

Robinson等[11]发现由双肉豆蔻磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine,DMPC)、胆固醇和双十八烷基二甲基溴化铵(dimethyldioctade-cylammonium bromide,DDAB)组成的阳离子脂质体和含有双肉豆蔻磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)成分的阴离子脂质体独立吸附于生物膜中的细菌,并且阴离子脂质体的吸附程度比阳离子脂质体小。脂质体装载有靶向杀菌剂三氯生作用于口腔生物膜中的微生物如血链球菌和唾液链球菌时,阴离子脂质体对血链球菌杀菌最有效。

Drulis-Kawa等[12]在体外铜绿假单胞菌药物传递研究中制备了不同阴阳离子组分比例的脂质体,结果发现这些脂质体制剂不仅能增加药物的稳定性和防止药物的泄露,而且能降低铜绿假单胞菌的最小抑制剂量。这与Robinson研究相似,阳离子脂质体更能有效地吸附于细菌生物膜。此外,Alhajlan等[13]将脂质体作用于肺部纤维化患者的铜绿假单胞菌菌株,发现携带有克拉霉素的脂质体将铜绿假单胞菌的最小抑制剂量从256 mg/L降低至8 mg/L,并且细菌生长形成生物膜的能力下降了3～4倍,同时脂质体包裹的药物对肺上皮细胞A549模型的毒性明显降低。

固体脂质纳米颗粒固体脂质纳米颗粒(solid lipid nanoparticles,SLN)是指由天然或合成高分子材料制成的粒径在50～1 000 nm的固体胶体微粒,替代药物传递系统的乳剂和纳米聚合颗粒[14]。SLN由固体脂质(如脂肪酸、三酰甘油)、乳化剂(如卵磷脂)和水组成,其毒性最小,不会引起排斥作用和无有机溶剂的残留[15],通常含亲水性或亲脂性表面活性剂,因此常用于生物利用率差的亲脂性药物口服传递。目前,固体脂质纳米颗粒已广泛用于临床,其中以Arikace TM为典型代表，其是一种脂质纳米胶囊包裹着阿米卡星新剂型[16]。蒙大拿州立大学生物膜工程的研究者们通过穿透假单胞菌生物膜的微观可视模型,评判Arikace TM穿透细菌生物膜的能力[17],发现铜绿假单胞菌菌落CF患者肺部形成凝胶样生物膜,在采用高效抗生素时很难清除细菌达到理想治疗效果,而Arikace TM能够穿透生物膜,将药物跨膜运输至生物膜内部,清除铜绿假单胞菌,明显增强了治疗效果。

微乳液微乳液(microemulsion,ME)是由油相、水相和表面活性剂及助表面活性剂组成的光学上均一、热力学及动力学稳定的体系,按结构可分为水包油(O/W)型、油包水(W/O)型和双连续型微乳[18]。用微乳液作为药物传递载体的优势在于:(1)可以提高药物的增容量，不管是水溶性还是脂溶性药物,在微乳液中的增容量要比在油和水溶解度之和还要高出很多;(2)药物在微乳液中避免与外界接触,提高药物的稳定性,降低药物的毒性;(3)药物在微乳液中保持与外界的浓度差,确保了药物持续释放,提高药物的生物利用度[19]。Al-Adham等[20]利用15%吐温80、6%戊醇、3%油酸乙酯和水组成的微乳液来研究抗生素对铜绿假单胞菌生物膜的功效,结果显示形成生物膜的铜绿假单胞菌显著减少,表明了微乳液作为抗菌药传递系统治疗生物膜细菌效果明显。Paula等[21]研究了由大豆油、Triton X-100乳化的三正丁基磷酸酯水包油型纳米微乳液(BCTP)和以吐温80为乳化剂、正戊醇为共乳化剂的油酸乙酯微乳液(TEOP)与鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和单核李斯特菌生物膜之间的作用,证实了BCTP和TEOP均能有效抑制5种细菌的生长,且对细菌的生物膜具有高效清除能力,但是对单核李斯特菌生物膜却没有明显作用。

高分子聚合物运载系统高分子聚合物运载系统是指将聚合物和抗菌药物通过共价键结合制备的高分子药物前体,具有提高药物稳定、赋予药物靶向性、提高药物水溶性和减少不良反应等,并长期用于医疗制药行业中[22]。目前,用于治疗生物膜微生物的高分子聚合物传递系统主要包括纳米颗粒、智能聚合物和树枝状大分子聚合物3类。

纳米颗粒纳米颗粒的聚合物作为药物递送载体具有高度吸引力是由于它们的高结构完整性,在储存过程中的稳定性,易于制备和官能化以及具有控制释放的能力。同样地,脂质-聚合物混合纳米颗粒保留了聚合物纳米颗粒的优点,同时脂质增强了生物相容性和延长循环时间[23]。Cheow等[24]研究了携带氟喹诺酮抗生素的脂质-聚合物混合纳米颗粒对生物膜铜绿假单胞菌和浮游铜绿假单胞菌的效果。结果表明,虽然脂质的涂层成分没有提高纳米颗粒对生物膜铜绿假单胞菌的吸附能力,但混合纳米粒子对成膜铜绿假单胞菌比浮游细菌具有明显的抑菌效果。Chisato等[25]使用场发射扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscopy,FE-SEM)成功地将可生物降解的聚合物纳米颗粒对形成生物膜表皮葡萄球菌的抗菌特性可视化,并比较了多聚乳酸-共-乙醇酸[poly(DLlactide-co-glycolide), PLGA]、脱乙醇壳多糖(chitosan,CS)改性的PLGA和脱乙醇壳多糖改性的PLGA携带克拉霉素(clarithromycin,CAM)3种可生物降解纳米颗粒对生物膜细菌的抗菌效果,发现CS-改性的PLGA携带CAM具有较高的生物膜抗菌能力。Aida等[26]将PLGA纳米颗粒装载环丙沙星并用DNase I官能化使得该纳米颗粒不仅能以受控制的方式释放环丙沙星,而且能降解稳定生物膜基质的胞外DNA,从而使生物膜降解。

控制口腔病原菌中生物膜的是具有挑战性的,洗必泰(chlorhexidine,CHX)是牙科广泛使用的一种抗微生物剂。Chaminda等[27]使用二氧化硅纳米颗粒包封CHX并评估了其对口腔生物膜的作用。50～200 μg/mL包封CHX纳米颗粒表现出对多种单个细菌和单种生物膜强效的抗菌作用,如变形链球菌、远缘链球菌、有核梭杆菌和放线杆菌等。此外,纳米颗粒通过修饰可以实现pH受控释放。最近,Benjamin等[28]利用二甲氨基-2-乙基甲基丙烯酸酯[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate,DMAEMA]、甲基丙烯酸丁酯(butyl methacrylate,BMA)和2-丙基丙烯酸(2-propylacrylic acid,PAA)嵌段聚合物自组装成直径为20 nm的阳离子纳米颗粒,通过载有疏水性抗菌药物金合欢醇作用于口腔生物膜。生物膜微环境酸化条件下生物膜毒力能够导致龋齿的产生,金合欢醇的释放是pH依赖性的,在pH4.5时释放能够有效地降低生物膜的毒力从而减少龋齿的产生,并且金合欢醇纳米颗粒清除生物膜的能力比自由金合欢醇提高了2倍多。金合欢醇纳米颗粒结合临床相关局部治疗方案能够有效地降低啮齿动物龋齿病模型体内生物膜的毒力,降低生物膜的数量和龋齿程度。

智能聚合物智能聚合物是一类对于外界微小的物理和化学刺激,自身某些物理和化学性质会发生相应改变的聚合物。据文献报道,智能聚合物可以用于游离细菌和生物膜细菌抗菌药物传递系统。Ruiz等[29]利用非交联型聚丙烯接枝-聚丙烯酸(polypropylene-grafted-polyacrylic acid,PP-g-PAAc)智能聚合物作为万古霉素传递载体研究其对耐氧甲西林金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用,结果表明PP-g-PAAc显著抑制耐西林金黄色葡萄球菌生物膜的形成。Schaer等[30]提出疏水性智能聚合物阳离子覆盖在不锈钢医疗设备的表面,能够最大限度地减少细菌生物膜的形成和相关感染。此外,Anderson等[31]研究表明,2-羟乙基甲基丙烯酸酯交联形成的水凝胶聚合物,表面有改性的十八烷基异氰酸酯,携带诺氟沙星作为模型药物。通过这些水凝胶不仅可以实现药物的近乎零级释放,而且诺氟沙星的抗微生物活性足以根除医学植入物表面单个或生物膜形式的表皮葡萄球菌。

树枝状大分子聚合物树枝状大分子是一类能够携带两个疏水和亲水实体的具有高度支化、三维、单分散的高分子化合物[32]。其结构一般由4部分组成:引发核心、空间空隙、分支点以及表面基团。树枝状的合成是通过一层接着一层的结构迭代形成的,用“代”数表示[33]。树枝状聚合物的药物递送可以通过高度支化封闭的空间空隙或通过终端表面基团进行修饰后,将抗菌药物靶向引导功能的物质连接在上面,这些发散的功能基团使得它们适用于各种药物传递,包括口服、经皮、眼、肺及目标或受控释放,从而使树枝状大分子聚合物在生物医药方面的研究显现出巨大潜力[34]。甲酰肽凝集素(LecB)是铜绿假单胞菌生物膜形成所必需;Johansson等[35]利用LecB配体高亲和α-C-岩藻糖基团多肽树枝状聚合物能完全抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成并能诱导几株临床铜绿假单胞菌株生物膜的完全分散从而有利于铜绿假单胞菌感染的治疗。Reymond等[36]发现糖肽树枝状聚合物能结合于铜绿假单胞菌凝集素LecB和LecA,这些凝集素与生物膜形成的抗生素抗性相关。LecB特定的糖肽树枝状聚合物FD2、D-FD2和LecA特定的糖肽树枝状聚合物GalAG2和GalBG2,能有效阻断体外绿脓杆菌生物膜形成和诱导生物膜分散。

一氧化氮(NO)具有广谱抗菌作用,基于NO的药物具有广阔的前景。NO释放树枝状聚合物表现出比NO更有效的杀菌作用并且有较高的载量。Lu等[37]将NO与聚酰氨基胺树枝状大分子[primary amine-functionalized poly(amido amine), PAMAM]结合成两亲性NO-释放聚酰胺-胺型树枝状大分子,使之达到1.0 μmol/mg的总载量,通过变化不同的侧链调节两亲性树枝状大分子的疏水性,可在对哺乳动物细胞影响最小的情况下根除细菌生物膜。最近,Brittany等[38]合成了各种大小的NO-释放烷基链改性的PAMAM,NO有效载量为1.0 μmol/mg。评价了这些树枝状大分子对革兰阴性菌和阳性菌细菌生物膜包括耐药菌株的杀菌效果,发现这些树枝状大分子的抗生物膜作用依赖于树枝状聚合物树枝状的代数、细菌的革兰类型和烷基链的长度。最有效地清除生物膜发生在抗菌剂高效地渗透到生物膜,增加NO浓度能有效穿透生物膜显著增强树枝状聚合物的抗生物膜活性。

无机药物传递系统随着无机化学和分子生物学的发展,人们从细胞及分子层次上认识到金属离子在生物体内的重要作用。据报道,目前针对生物膜细菌无机药物传递系统主要为金属及金属纳米粒子,其中包括银、金、铜、锌及铁盐等,其中银和铁盐广泛用于跨生物膜药物传递。

众所周知,银具有很强的抗菌性,尤其是经常报道的金属银、磺胺嘧啶银、银沸石和银纳米颗粒物。银在生物膜治疗中尤为重要,对革兰阴性和革兰阳性菌、真菌等均有抗菌作用[39];银离子除了能与DNA和RNA结合阻断细菌的复制和修复外还能和蛋白质、细菌核膜相互作用导致功能紊乱[40]。银纳米粒子本身具有抗菌作用,影响细菌的生物吸附和生物膜的结构。Mohantry等[41]在研究中证实,增加银纳米粒子的浓度能够抑制细菌合成胞外多糖形成生物膜。Radzig等[42]研究发现,银纳米颗粒对革兰阴性菌单个细菌和生物膜细菌有显著的抗菌作用,直径为8.3 nm并由水解酪肽稳定化的银纳米颗粒在浓度4～5、10和10～20μg/mL分别抑制大肠埃希菌AB1157、铜绿假单胞菌PAO1和变形斑沙雷菌94生物膜的形成。

在各式各样的铁盐中,尤其是枸橼酸铁铵,能够抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,并能够破坏成熟的生物膜。Musk等[43]提到高价的铁能够破坏从CF患者痰液中分离铜绿假单胞菌的生物膜及其形成生物膜相关组分。Subbiahdoss等[44]运用超顺磁性氧化铁纳米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)治疗生物膜相关的感染,SPIONs利用外部磁场靶向到感染部位,引起生物膜的深层渗透可有效地杀灭耐药菌株,利用羧基接枝的SPIONs将磁力集中在生物膜,能够显著抑制抗庆大霉素金黄色葡萄球菌正在形成的生物膜。

展望微生物生物膜由于其物理组成、结构以及复杂的群体效应形成一个特殊的微生物环境,给用药带来巨大的困难。随着生物医学的发展,给药系统也得到长足的发展,但是其中对生物膜细菌治疗效果未达到预期效果,而临床研究表明,病原菌感染80%是由生物膜引起的。本文就能够作用于形成生物膜的微生物及成熟生物膜的药物传递系统进行总结,其中脂质体和高分子聚合物能够将抗菌药物传递至生物膜起到杀菌和破坏生物膜的效果,而金属及金属纳米粒子不需要附加抗菌药物就可发挥抑菌作用并阻断细菌的群体效应破坏生物膜。目前研究药物传递系统严峻的问题就是会带来毒性作用和不良反应,随着生物膜潜在遗传及分子机制的逐渐阐明,将给药物传递系统提供新的思路，结合新型抗菌药物的不断研发,使临床上有效治疗生物膜感染治疗成为可能。

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Process of strategies for antimicrobial agent delivery to biofilm

FENG Meng-die1, ZENG Wei-kun1，2△

(1DepartmentofMedicalMicrobiology,MedicalFacultyofKunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,YunnanProvince,China;2DepartmentofClinicalLaboratory,MedicalFaculty,KunmingUniversity,Kunming650214,YunnanProvince,China)

【Abstract】Biofilm,a certain organizational structure,is formed by the attachment of single or mixed microbial communities to a variety of biological and/or synthetic surfaces.It contains microbes themselves and the secretion of polysaccharide matrix,fiber protein, and proteolipid proteins.In addition to help the bacteria resistant to a variety of environmental stresses,such as ultraviolet rays,bacteriophages and so on,more importantly,biofilm can block antibiotics access and diffuse to bacteria,which is one of the important mechanisms of pathogen resistance formation.In the course of pathogens treatment,it is necessary to select an effective antimicrobial agent,but for the forming biofilm pathogens,it is essential to deliver antimicrobial drugs effectively to biofilm for complete cure.In this article,strategies for antimicrobial drug delivery to biofilm are reviewed.

【Key words】antimicrobial agents;biofilm;drug delivery strategies

【中图分类号】R915

【文献标识码】B

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.022

(收稿日期:2015-07-15;编辑:王蔚)

国家自然科学基金(31160193);云南省教育厅科学研究基金重点项目(2015Z168)

△Corresponding authorE-mail:zengweikun@gmail.com

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31160193) and the Key Projects of Scientific Research Foundtion of Yunnan Educational Committee (2015Z168).