芦荟大黄素对体外胶质瘤细胞生物学行为的影响

陕西省商洛市镇安县医院神经外科(镇安711500) 李向忠 李 银 吴德文



芦荟大黄素对体外胶质瘤细胞生物学行为的影响

陕西省商洛市镇安县医院神经外科(镇安711500) 李向忠 李 银 吴德文△

目的：探讨芦荟大黄素(Aloe emodin，AE)在体外对胶质瘤SHG44细胞增殖、细胞周期、黏附、迁移和侵袭能力的影响。 方法：将体外人脑胶质瘤细胞分为两组，实验组经AE处理(AE浓度分别为20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L和160μmol/L),同时设对照组(未经药物处理)。采用CCK-8法检测AE处理后SHG44细胞的增殖情况；流式细胞仪分析细胞周期变化；细胞黏附实验检测细胞黏附能力，通过Transwell小室方法检测AE对SHG44细胞迁移和侵袭能力的影响。 结果：与对照组相比，AE处理胶质瘤SHG44细胞后，CCK-8法及流式细胞仪分析结果显示AE能抑制SHG44细胞增殖，并呈剂量依赖和时间依赖效应关系；对于细胞周期的影响主要变现为引起细胞发生S期阻滞；AE处理后能降低SHG44细胞的粘附能力；Transwell小室实验表明AE处理后的SHG44细胞迁移和侵袭能力明显降低。 结论：AE能通过阻滞细胞周期于S期而抑制胶质瘤SHG44细胞的增殖，并且下调胶质瘤细胞的黏附能力，降低细胞体外迁移及侵袭能力。

脑胶质瘤作为难治性肿瘤之一，发病率在脑肿瘤中占40%～50%[1]，具有侵袭性强和易复发等特点，手术难以完全切除，药物化疗和放射治疗也无法高度特异性地杀伤肿瘤细胞。因此，寻求新的治疗胶质瘤的方法具有极其重要的意义。芦荟大黄素(Aloe emodin，AE)作为传统中药中的一种生物活性成分,具有多方面作用[2],对肿瘤也有一定的抑制作用[3-4]。但目前有关AE对胶质瘤细胞生物学行为方面的研究鲜见文献报道。本研究在体外通过细胞培养,观察AE对体外人胶质瘤细胞株SHG44生物学行为的影响，为使用AE治疗胶质瘤提供实验依据。

材料与方法

1 细胞株及试剂 人脑胶质瘤SHG44细胞由西安医学院第一附属医院中心实验室提供。芦荟大黄素(纯度>95%)、DMSO试剂购自美国Sigma公司，CCK-8试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司，DMEM培养基与胎牛血清购自美国Hyclone公司，细胞周期检测试剂盒购自Becton Dickinson(BD)公司，Matrigel购自BD Biosciences公司，Transwell培养小室购自Millipore公司。

2 细胞培养 将胶质瘤SHG44细胞应用加入10%胎牛血清及100μg/ml青、链霉素的DMEM培养液培养，培养条件：37℃、5%CO2及饱和湿度。取对数生长期细胞进行实验。

3 CCK-8法检测胶质瘤细胞的增殖 选取对数期生长的SHG44细胞，经胰酶消化、计数，调整细胞浓度后以1×105个/ml浓度接种于96孔培养板内，每孔100μl，每组设5个复孔，24h后，加入不同浓度药物，使AE终浓度为20、40、80、160μmol/L，以等体积的DMSO溶液代替药物设置对照组，继续孵育。用CCK-8分别测定0、24、48和72h时细胞的增殖活性。检测前2 h，向每孔加入10μl CCK-8溶液，再在培养箱内37℃孵育2 h，用酶标仪测定450nm处各孔的吸光度值A值。计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%

4 流式细胞仪检测细胞周期 按照上述培养处理方法，将对照组及AE处理组培养48 h的细胞收集，2000 r/min离心5 min，弃上清液，加冰浴预冷的70%乙醇溶液并振荡，4℃固定，12h后用PBS洗去残留的乙醇，每管细胞样品中各加入15μl碘化丙啶(PI)染色液，室温条件下反应20 min，上机进行细胞周期检测。

5 细胞黏附实验 将Matrigel(50μg/ml)均匀铺于6孔板底部(100μl/孔)，对照孔加等体积1% BSA，于37℃孵育2h，弃去上清，4℃保存备用。收集预先经不同浓度AE处理24 h的SHG44细胞，制成单细胞悬液，以1×106个/孔的剂量接种于6孔板中，培养2 h后弃去培养液，PBS洗脱3次，用胰蛋白酶消化后重新收集细胞。计数细胞，以3个平行复孔的平均数作为黏附细胞数，计算黏附率：黏附率(%)=黏附细胞总数/总细胞数×100%。

6 细胞迁移实验 将胶质瘤细胞接种于6孔板，用不同浓度AE培养48h，分别收集各组细胞，调整细胞密度为1×105个/ml，将200μl细胞悬液接种于Transwell小室上室，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，孵箱中继续培养24h，取出Transwell小室，洗涤，用多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色15min，PBS漂洗3次，倒置光学显微镜下选取5个视野观察计算小室膜下的细胞数目，计算每个视野的平均细胞数，即表示细胞的迁移能力。

7 细胞侵袭实验 采用8μm孔径、6.5mm直径的Transwell小室，上室和下室之间以Matrigel胶和聚偏二氟乙烯(PVPF)膜模拟体内的基质和基底膜，其它步骤同迁移实验，最后计数5个视野穿膜细胞数，计算平均细胞数，表示肿瘤细胞的侵袭能力。

结 果

1AE对胶质瘤细胞增殖的抑制 经酶标仪检测各组的吸光度值并计算细胞增殖抑制率，表明AE在20～160μmol/L范围内能够抑制SHG44细胞的增殖,呈现一定的剂量依赖和时间依赖效应关系(图1)。

图1 不同浓度AE对SHG44胶质瘤细胞增殖抑制率

2AE对胶质瘤细胞周期的影响 经AE处理48h后，流式细胞术检测细胞周期，结果显示20、40、80、160μmol/LAE处理组被阻滞于S期的细胞数量分别为(9.93±0.38)%、(15.13±0.67)%、(21.59±0.94)%和(28.69±0.59)%，均较对照组(5.24±0.48)%明显增加(P<0.05)，各组实验组G0/G1期比例也略微增加，而G2/M期细胞比例则明显减少，差别具有统计学意义(P<0.05)(图2)。说明AE作用后可以影响胶质瘤SHG44细胞周期的进程，阻断胶质瘤细胞增殖周期于S期。

3AE对SHG44细胞粘附能力的影响 细胞粘附实验结果显示，20、40、80、160μmol/L的黏附率分别为(38.24±5.16)%、(31.82±4.02)%、(23. 21±3.27)%、(14.03±3.15)%，与对照组(46.39±5.54)%比较，有统计学差异(P均<0.05)，说明AE处理后能抑制SHG44细胞的粘附(图3)。

图2 流式细胞仪检测不同浓度AE处理后细胞周期的变化(1：对照组；2：20μmol/L组；3：40μmol/L组；4：80μmol/L组；5：160μmol/L组)

图3 各组胶质瘤细胞黏附率比较(*P<0.05)

4AE对SHG44 细胞迁移及侵袭能力的影响 各处理组在AE作用48h后进行Transwell实验，结果如附表所示，AE各浓度均能减少迁移及侵袭实验中的穿膜细胞数，差异均具有统计学意义(P<0.05)，说明AE可以降低胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力。

附表 不同浓度AE对胶质瘤SHG44细胞迁移及侵袭的影响

讨 论

脑胶质瘤是原发性中枢神经系统肿瘤中最常见的类型，尽管临床上有手术、药物及放化疗等各种治疗手段，但其病死率、复发率仍居高不下。AE是蓼科大黄属植物中的活性成分,属于蒽醌类物质,目前国内外已经报道了AE在体外对胃癌[5]、甲状腺癌[6]、乳腺癌[7]、黑色素瘤[8]和口腔癌[9]等多种肿瘤细胞的增殖都有抑制作用,但是对不同的细胞系, 抗扩增的机制并不相同[4]。杨大庆[10]报道，芦荟大黄素通过抑制肿瘤细胞蛋白质合成所需的肽链延长因子eFF-2和肽转移酶的活性，抵制肿瘤细胞的增殖。

本实验使用体外细胞模型研究了AE对SHG44细胞增殖、细胞周期、转移及侵袭能力等生物学行为的影响。研究结果显示，AE作用于SHG44细胞后，细胞增殖速度减慢，生长受到抑制，S期细胞所占比例增高，证实AE通过阻滞细胞周期于S期，减慢细胞周期进程，从而抑制胶质瘤细胞的增殖。

对于不同的肿瘤类型，AE产生细胞周期阻滞的阶段并不完全一样。在胃癌SGC-7901细胞[11]及鼻咽癌细胞[12]中，AE使得细胞周期阻滞于G2/M期，其机制可能涉及cyclinB1和周期蛋白依赖性激酶1(cdk1)的升高。而在人胶质瘤U87株细胞[13]及U-373MG细胞[14]中AE阻滞细胞周期于S期，其机制则可能与蛋白激酶C(PKC)活性的抑制有关。本研究在胶质瘤SHG44细胞中的关于细胞周期进程的研究结果与文献基本一致，但其具体机制尚需进一步研究。

侵袭与转移是恶性肿瘤的特征，癌细胞通过粘附、局部蛋白酶水解、运动3个步骤的反复进行，导致肿瘤向深部组织侵袭及转移。本文黏附实验结果表明AE作用后能降低胶质瘤细胞黏附基底膜的能力,既往HeTP等在高转移人卵巢癌细胞系HO-8910PM中也发现AE可以显著性抑制肿瘤细胞的黏附能力[15]。关于粘附特性在肿瘤行为中的作用，一方面，肿瘤细胞必须与原来的肿瘤组织脱粘附，才能开始侵袭，故粘附在肿瘤细胞侵袭中起抑制作用；另一方面，肿瘤细胞需要依靠粘附才能在新的部位与基底膜成分结合，形成新的转移灶，故粘附在肿瘤细胞转移中起促进作用。本研究显示AE抑制SHG44细胞粘附Matrigel基质胶，然而这种作用究竟是促进还是抑制胶质瘤细胞的侵袭和转移，尚需进一步研究。

有研究报道，用鼻咽癌[12]和乳腺癌[7]、膀胱癌[16]和卵巢癌[15]等细胞研究AE的抗肿瘤作用，结果表明AE能抑制肿瘤细胞侵袭和转移。但是，在结肠癌SW620细胞中的研究与上述情况则刚好相反，即AE的作用能增强肿瘤细胞侵袭能力[17]。以上情况表明AE在不同的肿瘤细胞中的作用不全相同，这提示我们必须进一步研究以明确AE在各种类型肿瘤细胞中的实际效果。

本实验中，笔者通过Transwell小室的实验方法利用细胞模型在体外证实AE具有降低胶质瘤SHG44细胞侵袭及迁移能力的作用。有研究证实，在鼻咽癌[12]、黑色素瘤[17]、舌癌[18]及结肠癌[19]中AE可以通过下调MMP-2及MMP-9等的表达来抑制肿瘤的迁移和侵袭。MMP-2与MMP-9是与肿瘤浸润及转移关系最为密切的MMPs家族[20]。MMP-2 主要通过特异性降解基膜的主要成分Ⅳ、Ⅴ型胶原，对肿瘤的侵袭转移有重要作用[21]。MMP-9 可降解多种基质成分，破坏基膜，导致肿瘤细胞的浸润转移[22]。

本文实验结果表明，AE能通过抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、降低迁移及侵袭能力等多种途径发挥抗胶质瘤作用，提示AE有望成为抗胶质瘤药物。当然，体外实验与体内肿瘤组织的生物学行为存在很大差异，还需在肿瘤动物模型上进一步探讨和验证，并对其作用机制进行深入研究，从而为临床应用AE治疗胶质瘤提供实验依据。

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(收稿：2016-05-23)

芦荟大黄素/药理学 神经胶质瘤/病理生理学 细胞增殖抑制或刺激药(中药) 体外发生 细胞迁移 抑制

R915

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.006

△西安医学院第一附属医院神经外科