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氧化苦参碱干预TGF-β1诱导A549细胞上皮-间质转化作用研究*

2016-12-15沈阳军区总医院呼吸科沈阳110016孙文武

陕西医学杂志 2016年11期
关键词:苦参碱肺纤维化肺泡

沈阳军区总医院呼吸科(沈阳110016) 刘 蕾 马 壮 谢 华 孙文武



·论著·基础研究·

氧化苦参碱干预TGF-β1诱导A549细胞上皮-间质转化作用研究*

沈阳军区总医院呼吸科(沈阳110016) 刘 蕾 马 壮 谢 华 孙文武

目的:探讨氧化苦参碱(Oxy)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肺泡上皮细胞间质转化的干预作用,期望为肺纤维化治疗提供新的候选药物。方法:选用0.25、0.5、1 mg/ml氧化苦参碱预处理A549细胞30 min后,再给与(5 ng/ml)TGF-β1共孵育培养48 h,MTT法检测细胞增殖变化,光镜下观察细胞形态变化,Western blot检测TGF-β1下游信号分子Smad2/3磷酸化变化和EMT标志分子E-candherin、N-cadherin和Vimentin表达变化。结果:氧化苦参碱能有效干预TGF-β1诱导A549细胞细胞增殖、细胞形态变化,抑制TGF-β1介导的Smad2/3磷酸化和E-candherin表达下调、N-cadherin和Vimentin表达上升。结论:氧化苦参碱能有效抑制TGF-β1诱导A549细胞上皮-间质转化,氧化苦参碱可以作为抗肺纤维化治疗的候选药物。

肺纤维化(Pulmonary fibrosis,PF)是各种不同病因所致肺部疾病的共同结局,包括特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)、结节病、尘肺、过敏性肺炎、药物和放射线导致肺纤维化以及与胶原血管病有关的致肺纤维化肺泡炎等。肺纤维化的致死率高,5年生存率仅次于肺癌,且其发病率正呈逐年上升趋势[1]。肺纤维化的发病机制复杂,目前研究认为上皮细胞受损后发生上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)转变为成纤维细胞,同时成纤维细胞发生异常增殖是肺纤维化形成的两个主要环节[2]。转化生长因子β1(Transforming growth factor,TGF-β1)是一种重要的致纤维化生长因子,能够通过其下游TGF-β受体以及Smads蛋白刺激成纤维细胞增殖和胶原的合成,促进胶原蛋白、纤维连接蛋白、透明质酸、蛋白聚糖等在细胞外基质中沉淀,减少细胞外基质的降解,在很多器官纤维化疾病中都被认为是纤维化的“总开关”[3]。研究报道指出,TGF-β1介导的肺泡上皮细胞EMT是介导肺纤维化的主要机制之一[4]。氧化苦参碱(Oxymatnine, Oxy),又称苦参碱,是从豆科植物苦参(Sophora flavescens ait)或萍科植物广豆根(Sophora subprostrata)中分离出来的生物碱。研究表明其能够直接抑制乙型肝炎的复制,并能够阻断肝细胞的凋亡同时抑制肝纤维化的发生[5]。本研究中,我们体外培养人肺泡II型上皮细胞A549,TGF-β1诱导其发生EMT,使用氧化苦参碱干预处理,观察对细胞增殖、细胞形态、细胞EMT发生的影响,期望为肺纤维化治疗提供新的候选药物,有效提高肺纤维化患者的治疗效果和生存率。

材料和方法

1 实验材料 人肺泡II型上皮细胞A549购自北京协和医学研究所细胞库;TGF-β1重组蛋白购自 Sigma公司(纯度分别 >99%);氧化苦参碱购自Baomanbio公司(纯度分别>99%);兔抗人Smad2/3、p-Smad2/3、E-candherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin 多克隆抗体和HRP 标记羊抗兔 IgG 购自沈阳万类科技有限公司;ECL 化学发光试剂盒为 Pierce 公司产品;DMEM培养培养基为 Gibco 公司产品,细胞培养所用胎牛血清购自Hyclone公司;其他生化试剂为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 细胞培养: 人肺泡A549细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,置于饱和湿度,5%CO2的细胞培养箱中培养,隔天换液,每天用倒置显微镜观察细胞形态以及细胞生长情况,待细胞长至80%融合时进行消化传代。

2.2 实验分组: 对数生长期A549细胞随机分为5组:A:对照组(Control);B:TGF-β1处理组(TGF-β1);C:TGF-β1+氧化苦参碱低剂量组(TGF-β1+L-Oxy);D:TGF-β1+氧化苦参碱中剂量组(TGF-β1+M-Oxy);E:TGF-β1+氧化苦参碱高剂量组(TGF-β1+H-Oxy)。氧化苦参碱预处理30 min后,再给与(5 ng/ml)TGF-β1共孵育培养48 h,氧化苦参碱参考剂量分别为0.25、0.5、1 mg/ml。

2.3 MTT法检测氧化苦参碱干预对TGF-β1诱导A549细胞增殖的影响: 选择对数生长期的A549细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,按2000/孔的密度接种于96孔板,待细胞贴壁后换液为无血清培养液继续培养24 h,分别加入浓度为0、0.25、0.5、1 mg/ml氧化苦参碱预处理30 min后,再给与(5 ng/ml)TGF-β1共孵育48 h,每组设置5个复孔,置于细胞培养箱中培养,48 h后分别加入5 g/L的MTT 20 μl,继续孵育4 h,弃去上清,加入DMSO 150 μl,充分震荡20 min,于酶标仪上测定其在490 nm处的吸光度值。

2.4 Western blot检测各组细胞TGF-β信号通路以及EMT相关指标的表达: 收集各组细胞后加入蛋白裂解液及PMSF,冰上放置40 min,4℃ 12000 rpm/min离心40 min,取上清,BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白样品,于10%聚丙烯酰胺凝胶上行SDS-PAGE,电泳结束后100 V电转印至PVDF膜上。将PVDF膜放入封闭液中37℃封闭1 h,稀释一抗4℃孵育过夜。PBS洗膜4次,加入碱性磷酸酶标记的稀释二抗孵育,37℃震摇1 h,洗膜。ECL发光法曝光成像,扫描入电脑并进行灰度分析。

3 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件。各组实验测试指标经Shapiro-Wilk检验呈正态分布,以平均值±标准差表示,经F检验证实方差齐。采用单因素方差分析,组间的两两比较均采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 氧化苦参碱干预TGF-β1诱导A549细胞增殖 MTT法检测细胞增殖,测量OD490值代表细胞数的多少,体现细胞增殖能力的变化。按照实验分组干预处理48h得到氧化苦参碱(Oxy)干预后,TGF-β1诱导A549细胞增殖能力逐渐减弱,低中高Oxy干预组与TGF-β1处理组相比,差异均具有统计学意义(P<0.01);与正常对照组相比无统计学差异(P>0.05)。表明Oxy能有效抑制TGF-β1诱导的A549细胞增殖,见表1。

表1 氧化苦参碱干预TGF-β1诱导A549细胞增殖的影响

2 氧化苦参碱干预TGF-β1诱导A549细胞形态变化 荧光显微镜下观察细胞形态学变化,得到与对照组细胞相比,TGF-β1处理细胞与邻近细胞分离,细胞形态从鹅卵石状转变为长梭形,由上皮性细胞转化为间充质细胞状。低中高浓度Oxy干预后,细胞形态变化有所缓解,其中高浓度Oxy干预效果最佳,细胞形态与对照组相比未有明显改变(图1)。表明Oxy能有效抑制TGF-β1诱导的A549细胞间充质状转化。

3 氧化苦参碱干预TGF-β1诱导A549细胞上皮-间质转化 TGF-β1活化Smad2/3信号调控上皮细胞EMT发生。Western blot 法检测Smad2/3、p-Smad2/3表达得到,TGF-β1处理后 p-Smad2/3表达上调,使用Oxy干预后,能有效抑制p-Smad2/3,高浓度Oxy作用后p-Smad2/3表达下调最明显(图2A)。表明Oxy能有效干预TGF-β1/Smad2/3信号活化。同时检测EMT标记分子的表达变化,得到TGF-β1处理后,A549细胞上皮标记分子E-candherin表达降低,间质标记分子N-cadherin和Vimentin的表达上调,Oxy干预能有效恢复E-candherin表达,降低N-cadherin和Vimentin的表达,高浓素Oxy作用效果更明显(图2B)。表明氧化苦参碱能有效抑制TGF-β1诱导的A549细胞上皮-间质转化,其可能的机制为干预TGF-β1/Smad2/3信号活化。

图2 氧化苦参碱干预TGF-β1诱导A549细胞上皮-间质转化[A:Western blot 法检测TGF-β1下游信号Smad2/3的活化(p- Smad2/3的表达);B:Western blot 法检测细胞上皮-间质转化的标志分子E-candherin、N-cadherin和Vimentin的表达]

讨 论

EMT在肺纤维化发生中发挥重要作用,抑制EMT发生有助于缓解肺纤维化[6]。本研究通过使用TGF-β1体外处理肺泡Ⅱ型上皮细胞A549,诱导细胞EMT发生;通过氧化苦参碱干预,得到氧化苦参碱能够有效抑制TGF-β1诱导的细胞增殖、细胞形态的改变;并检测得到氧化苦参碱能够有效抑制TGF-β1下游信号分子Smad2/3的磷酸化,抑制间质细胞标志分子N-cadherin和Vimentin的表达,恢复E-candherin的表达。这些提示氧化苦参碱可能通过干预TGF-β1介导的Smad2/3的活化,抑制A549细胞EMT;氧化苦参碱可以作为抗肺纤维治疗获选药物。

研究显示,在多种肺疾病中,例如哮喘、慢性阻塞性肺病、先天性肺纤维化、博来霉素诱导的肺纤维化等病理损害诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维母细胞分化通过上皮-间质转化,丧失正常表皮完整性,细胞粘附分子E-candherin和ZO-1表达丢失;增加间质表型分子的表达如N-cadherin和Vimentin,增强细胞外基质产生能力,介导肺纤维化的发生[7]。在PF早期阶段肺泡巨噬细胞数量和活性增多,合成释放大量具有多种活性的细胞因子、前炎性介质、趋化因子及蛋白酶类;TGF-β1是关键的纤维相关因子,其能有效诱导上皮性细胞发生EMT转化,增殖分化为肌成纤维细胞母细胞,诱导肺纤维组织的细胞外基质大量产生,当肺泡Ⅱ型上皮细胞慢性接触TGF-β1后细胞将经历EMT[8]。研究发现TGF-β1在百草枯处理的大鼠血清和肺组织增加,TGF-β1 mRNA表达水平逐渐增加在第7天达到一个峰值,且TGF-β1增加在羟基脯氨酸和胶原蛋白增加之前,干预TGF-β1/Smads信号活化后将有效抑制肺纤维化,上皮间质转化的发生[11]。本研究中,体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞A549,使用TGF-β1处理,观测得到TGF-β1处理能有效促进细胞增殖、细胞形态发生变化,细胞间粘附减少,细胞呈长梭形,表现间质样表型;同时检测细胞EMT标记分子得到E-candherin表达降低、N-cadherin和Vimentin表达增加。表明已成功建立TGF-β1诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞的EMT转化。

氧化苦参碱具有广泛的抗肿瘤、抗心律失常、抗炎以及抗病毒等多种药理作用,苦参碱及其制剂的开发与应用已成为近年来药学领域的热门课题之一[10]。马鹏等[11]报道,氧化苦参碱能够改善晚期肝癌患者肝功能,降低AFP、CEA和CA125,延长患者生存时间。张静等[12]报道,氧化苦参碱可使慢性中度乙肝患者肝功能复常,胶原纤维下降及凝血酶原活动度恢复得到明显改善。已有的研究提示氧化苦参碱能够通过抑制TGF-β1诱导的Smad3的磷酸化和核转移有效抑制瘢痕纤维母细胞胶原蛋白的表达[13],通过抑制NF-κB通路减少炎性细胞因子生成,进而抑制肾纤维化[14]。我们的前期研究证实氧化苦参碱能够通过有效缓解小鼠肺纤维化,抑制炎症反应和氧化应激损伤,下调炎症因子TNF-α和IL-6的表达,降低MPO活性和MDA水平,并能有效抑制TGF-β1的表达及其下游信号分子Smad2/3的活化[15]。本研究中,通过使用高、中、低三个浓度的氧化苦参碱干预TGF-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞的EMT转化,得到氧化苦参碱能有效抑制TGF-β1诱导的增殖、细胞形态的间质变化,恢复E-candherin的表达,降低N-cadherin和Vimentin表达,且可能的机制亦与干预Smad2/3的活化有关。表明氧化苦参碱能有效干预TGF-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞上皮机制转化,可能成为有效的抗肺纤维化药物。

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(收稿:2016-01-14)

Effect of oxymatnine on TGF-β1 inducing A549 epithelial to mesenchymal cell transition Department of Respiratory Diseases,Shenyang Military Region General Hospital

(Shen yang 110016) Liu Lei Ma Zhuang Xie Hua et al

Objective: We investigated the effect of Oxymatnine (Oxy) on TGF-β1 inducing alveolar epithelial to mesenchymal cell transition, and hope to provide a new candidate for the treatment of pulmonary fibrosis. Methods: After treatment with 0.25, 0.5, 1 mg/ml Oxy separately for 30 min , A549 cells were co-incubation with TGF-β1 (5 ng/ml) for 48h to detecte the cell proliferation changes by MTT, observed the cell morphological changes through microscopy, and analyzed the expression of phosphorylation of Smad2/3and EMT marker molecules E-candherin, N-cadherin and Vimentin by Western blotting. Results: Oxy could effectively interfere with the cellular proliferation and cell morphological changes, inhibited the expression phosphorylation of Smad2/3, E-candherin down-regulated,and N-cadherin and Vimentin up-regulated mediated by TGF-β1. Conclusion: Oxymatrine could inhibit TGF-β1 induced A549 cells epithelial - mesenchymal transition, Oxymatrine could been used as a new candidate drugs for treatment of pulmonary fibrosis.

Oxymatrine Pulmonary fibrosis/physiopathology Transforming growth factor beta 1 Epithelial cells Cell line,transformed

*辽宁省博士启动基金资助项目(20141175)

氧化苦参碱 肺纤维化/病理生理学 转化生长因子β1 上皮细胞 细胞系,转化

R364.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.001

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