微小RNA介导慢性创面愈合机制研究进展

2016-12-15张笑天柴益民

国际骨科学杂志 2016年6期

张笑天柴益民

微小RNA介导慢性创面愈合机制研究进展

张笑天柴益民

微小RNA(miRNA)广泛存在于人体各组织器官中，调控细胞新陈代谢全过程。目前认为miRNA调节异常可能参与了难愈伤口的形成，但其确切发病机制和相关分子生物学改变仍存有争议。研究表明，miRNA以各种方式在创面炎症反应阶段、细胞增殖阶段和组织重建阶段调控炎症。各种体外、体内实验研究的关注点也集中在miRNA介导慢性创面愈合作用机制上。该文就miRNA介导慢性创面愈合机制作一综述。

微小RNA；慢性创面；炎症反应；低氧诱导因子； dicer酶；血管新生

慢性创面是指超过4周未愈合或长期不愈合的伤口及其他皮肤表面连续性的中断。慢性创面长期停留于创面愈合的第一阶段，即炎症反应期，典型的慢性创面包括糖尿病足溃疡、静脉溃疡和压疮等，临床上常引起一系列并发症。近年来研究[1-3]发现，微小RNA(miRNA)可能参与难愈伤口的形成。

1 定义及生理功能

1.1 定义及特征

miRNA是一类仅包含21～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA，在物种进化中相当保守[1]，可调控多达50%的基因表达[4]。

miRNA有3大特征：①广泛存在于真核生物中，是一类短链非编码RNA序列，无开放阅读框(ORF)；②其长度尚无统一标准，但大多数在21～25 nt，3’端可有1～2 nt的长度变化；③成熟的miRNA 有5’端磷酸基和3’端羟基，这使其有别于其他寡核苷酸及功能RNA降解片段。此外，miRNA在生物进化中相当保守，仅在特定组织细胞及其发生发展的特定阶段表达。

1.2 生理功能

miRNA广泛存在于人体各组织器官中，调控细胞新陈代谢全过程。有研究[3，5]通过与编码蛋白质的信使RNA(mRNA)结合方式使其降解或抑制其翻译。首先由RNA聚合酶Ⅱ合成原miRNA，然后通过核糖核酸酶(RNase)Ⅲ/drosha酶/迪格奥尔综合征染色体区域(DGCR)8复合体再次加工形成发卡形结构的前体miRNA(约70 nt)，输出蛋白(XPO)5将其转运至细胞质，最后dicer酶将其加工形成成熟miRNA，成熟miRNA通过RNA诱导沉默复合体(RISC)与靶mRNA相互作用[6]，其互补链被迅速降解。miRNA与靶mRNA遵循碱基互补配对原则，通常miRNA结合于3’端非编码区，也有miRNA直接结合于编码区、内含子外显子交界处或5’端非编码区来影响mRNA[7-8]。miRNA与mRNA结合并使其退变及抑制其翻译(图1)。

图1 miRNA与编码蛋白质的mRNA结合使其降解或抑制其翻译过程

2 影响创面愈合机制

miRNA存在于人体所有组织中，起到调节细胞增殖、分化、凋亡等进程的作用。基于miRNA的基因沉默机制在创面修复过程中至关重要。人为调控miRNA的整体或局部表达水平可激发难愈伤口的修复潜力[2]。

2.1 在炎症反应阶段中的作用

作为创面愈合的第一步，炎症反应阶段从皮肤连续性一中断便开始，逐渐出现伤口出血，纤维蛋白沉积，趋化因子和细胞因子如血小板源性生长因子(PDGF)、白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α等随血流到达创面。由于皮肤屏障功能被破坏，其下组织易受病原体侵袭，感染概率大大增加。免疫细胞因上述趋化因子和细胞因子而迁移至伤口处。这些信号分子的分泌及受体基因的表达都属于miRNA调控炎症反应的方式。

2.1.1 miRNA与Toll样受体

炎症细胞(包括巨噬细胞及中性粒细胞)通过Toll样受体(TLR)来识别病原体。最先报道miRNA与炎症反应有关的是关于脂多糖(LPS)TLR4配体的研究，认为miRNA可诱导miRNA-146a、miRNA-155和miRNA-132表达[9]。其中，miRNA-155首次被发现可通过TLR配体、炎性因子及特定抗原参与炎症反应。miRNA-155调控多种参与慢性创面中对病原体进行细胞免疫应答的蛋白[10]，可直接抑制负向调控TLR信号转导通路的分子SHIP1[11]，且miRNA-155通过影响LPS信号转导通路调节点如Fas相关死亡域蛋白(FADD)、受体相互作用蛋白激酶(RIPK)1等间接加强TNF-α的翻译[12]。此外，LPS诱导下调miRNA-125b的同时也促进TNF-α的产生，因为miRNA-125b可与TNF-α的3’端非编码区相结合来抑制其翻译[13]。同时，miRNA-146a、miRNA-155和miRNA-132也受TNF-α的调节。

研究[14]发现，miRNA-146a广泛参与炎症反应的抑制，特别是在固有免疫系统内。IL-1受体关联激酶 (IRAK)1和肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6是miRNA-146a下调IL-8、T细胞表达和分泌调节性激活因子(RANTES)的2个主要途径，IRAK2也是 miRNA-146a的靶蛋白之一，它能调节干扰素(IFN)-γ[15]。在糖尿病大鼠创面中，miRNA-146a下调，从而增加其下游炎症前体基因的表达[13,16]。miRNA-146a也被认为是对固有免疫以及获得性免疫过度激活的重要生理保护机制[17]。巨噬细胞受miRNA-146a 和miRNA-155的调节，它们促进使单核细胞分化为巨噬细胞所必需的细胞因子分泌，从而调节巨噬细胞[18-19]。

受miRNA-21影响的程序性细胞死亡因子(PDCD)4可以调控TLR-4介导的炎症[20]。在创伤处，巨噬细胞有效清除坏死细胞是抑制炎症的先决条件，内源性脂类调节因子Resolvin D1在炎症反应期能诱导产生miRNA-21，而miRNA-21可参与急性炎症的消散过程[21]。miRNA-21能沉默PTEN基因、糖原合成酶激酶(GSK)-3β和PDCD4等炎症反应中的关键影响因子[22]。miRNA-146a、miRNA-155与miRNA-21均与伤口愈合进程相关[23-24]。

2.1.2 miRNA与细胞趋化黏附

除上述TLR信号转导通路受miRNA调控外，选择素E和细胞间黏附分子(ICAM)-1分别是miRNA-31和miRNA-17-3p的直接作用目标[17,25]。单核细胞趋化蛋白(MCP)-1在单核-巨噬细胞趋化作用中有重要地位。在创面中，MCP-1表达明显上调(约70倍)[26]，而miRNA-124a参与MCP-1基因转录后的沉默[27]。

2.2 在细胞增殖阶段中的作用

细胞增殖阶段往往开始于伤后2～3 d，包括伤口处纤维母细胞募集形成肉芽组织、胶原和黏多糖沉积、表皮细胞分化、角质形成以及伤口收缩等过程。伤后1周时，纤维母细胞成为伤口最主要的细胞类型。miRNA-155能加快纤维母细胞迁移[28]。成纤维细胞分泌胶原、纤粘连蛋白形成新细胞外基质(ECM)的基础。miRNA-21、miRNA-99、miRNA-155、miRNA-184、miRNA-198、miRNA-203、miRNA-205、miRNA-210和miRNA-483-3p等均参与调节角质细胞发生、分化及迁移[23,28-33]。

2.2.1 oxymiR与血管新生

在细胞增殖期中，细胞低氧状态是诱导宿主产生适应性血管新生的因素之一，低氧环境对创面血管内皮细胞有益，而新生血管能为伤口愈合区域带来足够的氧气和营养。涉及组织氧化还原反应的miRNA被称为oxymiR[34]，其可能直接或通过影响低氧敏感的翻译因子、pH值、生物代谢等方式影响组织氧化状态。低氧诱导因子(HIF)是人体内低氧微环境最重要的调节因子，有明显的促血管生成能力。HIF在细胞内稳定存在时，可诱导许多对低氧敏感的oxymiR产生[35]。HIF激活基因包括血管内皮生长因子(VEGF)、正葡萄糖转运蛋白(GLUT)1等，可促进血管新生[36]。低氧敏感的miRNA包括miRNA-23、miRNA-24、miRNA-26、miRNA-27、miRNA-103、miRNA-107、miRNA-181、miRNA-210和miRNA-213等，其翻译受HIF调控[37]。在炎症反应及细胞增殖阶段初期，组织因新生毛细血管网络而呈红色。参与血管新生的miRNA有miRNA-15b、miRNA-16、miRNA-17、miRNA-92、miRNA-126、miRNA-130a、miRNA-210、miRNA-221、miRNA-222、miRNA-296、miRNA-320、miRNA-378和miRNA-503等[33,38-54]。其中miRNA-210是影响缺血伤口关闭的关键因子，它能通过沉默相关基因来减缓角质细胞生长并抑制其线粒体功能。在大鼠和患者的慢性创面中，miRNA-210表达明显增高，乳酸盐水平同样增高。为使细胞适应低氧环境，乳酸可激活HIF-1α细胞通路[55]，也可增加miRNA-210表达。转录因子E2F3表达受miRNA-210的调控，在缺血创面其含量明显降低，而在非缺血创面则含量较高。在缺血创面边缘处，E2F3显著下调。相反，部分miRNA也同样能影响HIF的稳定性。miRNA-424能使HIF-1α稳定，而使HIF-1α翻译的miRNA(如miRNA-20b、miRNA-199a和miRNA-17～92等)受抑制，从而增加HIF-1α的表达和翻译[56-57]。通过检测低氧敏感的oxymiR可以发现潜在难愈创面，为之后的治疗提供可能。

2.2.2 dicer酶与血管新生

在低氧条件下，由于细胞缺乏氧分子，呼吸链被抑制。为了生存，细胞会转需氧代谢为厌氧代谢。低氧环境使细胞尽可能紧缩能量开支以维持生存。细胞微环境氧含量能影响细胞的生存方式及功能，也影响其基因表达。慢性低氧环境会损害dicer酶(尤其是dicer1酶)的表达和激活，从而降低miRNA生物效应。研究[58]表明，当角质细胞dicer酶受抑制时，皮肤恢复屏障功能受到严重扰乱，并影响伤口愈合。血管再生的各方面(如血管内皮细胞生成、增殖、分化等)都受特定miRNA的调控。这些miRNA被称为angiomiR，包括miRNA-17-5p、miRNA-17-92cluster、miRNA-15b、miRNA-16、miRNA-20、miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-23b、miRNA-24、miRNA-27a、miRNA-29a、miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-31、miRNA-100、miRNA-103、miRNA-106、miRNA-125a、miRNA-b、miRNA-126、miRNA-181a、miRNA-191、miRNA-199a、miRNA-221、miRNA-222、miRNA-320和let-7家族等[59-60]。研究[34]发现，在敲除dicer酶基因的人内皮细胞中佛波酯、TNF-α或VEGF诱导产生的活性氧簇(ROS)水平降低。ROS是创面血管新生重要的第二信使。转录因子HBP1可下调p47phox的表达，它在dicer酶基因敲减时表达也减少。敲除HBP1可恢复产生ROS以及修复内皮细胞由于miRNA缺陷导致的血管新生障碍[61]。此外，Argonaute蛋白(Ago)2在细胞处于低氧状态时含量增加，它能诱导一些不依赖dicer酶的miRNA产生。低氧条件下，Ago2羟化并与热休克蛋白(HSP)90结合，将miRNA转移至RISC并运送至应激颗粒(SG)[62]。低氧或线粒体功能异常会引起不同基因表达，对伤口愈合有着深远意义。

2.2.3 miRNA与VEGF

低氧抑制的miRNA-200b通过直接作用于转录因子Ets-1来参与诱导血管新生过程[63]。某些特定转录因子Ets-1基因如基质金属蛋白酶(MMP)-1和血管内皮生长因子受体(VEGFR)-2能被miRNA-200b沉默。转录因子Ets-1过表达可逆转miRNA-200b造成的血管新生抑制效应。VEFG 和成纤维细胞生长因子(FGF)-2相互作用可促进伤口血管新生。在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中，VEGF-A可诱导产生miRNA-191、miRNA-155、miRNA-31、miRNA-17-5p、miRNA-18a和miRNA-20a[64]。VEGF-A 和 FGF-2都能诱导miRNA-130a表达，还能通过磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(P-CREB)来转录miRNA-132，促进内皮细胞增殖[65]。miRNA-221 和 miRNA-222可调节c-Kit的表达，它们相互作用形成环路调控内皮细胞新生毛细血管形成[66]。c-Kit表达受抑制可导致VEGF表达下降[67]。

2.2.4 角质形成细胞与miRNA

角质形成细胞从伤口边缘迁移到伤口部位并开始增殖和分化恢复皮肤屏障的过程由各种不同miRNA(包括miRNA-198、miRNA-203和miRNA-483-3p等)调控[30-32]。miRNA-1也能被低氧诱导产生，在人和鼠缺血创面表达显著提高，它可直接降低酪氨酸蛋白激酶受体(c-met)水平，使水通道蛋白(角质细胞迁移的重要蛋白)3表达降低[68]。因此，过表达miRNA-1会抑制细胞迁移。miRNA-21也能通过沉默胰岛素样生长因子(IGF)-1来干扰细胞迁移[69]。

2.3 在组织重建阶段中的作用

组织重建阶段包括ECM调整、胶原重组(Ⅲ型胶原转化为Ⅰ型胶原)和临时肉芽组织被瘢痕组织所替代，起始于伤口关闭。在组织重建阶段，新生血管减少，细胞活动变安静。具体而言，miRNA-29a能通过接头蛋白(TAB)1来调节真皮成纤维细胞的收缩功能[70]。miRNA-192/215通过抑制E盒结合锌指蛋白(ZEB)2的翻译来增加上皮细胞钙黏附蛋白的表达[41]，而上皮细胞钙黏附蛋白在重建皮肤屏障完整性中起重要作用。miRNA在组织重塑阶段中的调控作用仍需进一步研究来揭示。

3 介导慢性创面愈合机制

3.1 体外实验

3.1.1 miRNA-21与miRNA-130a

在人类上皮角质形成细胞(HaCaT)中，miRNA-21受转化生长因子(TGF)-β1上调，而miRNA-21过度表达可增强角化细胞迁移能力,miRNA-21敲减可抑制TGF-β1诱导角质形成细胞的迁移，表明miRNA-21在TGF-β促进角化细胞迁移中起重要作用[23]。Pastar等[71]对原代人类角质细胞模型进行研究，发现miRNA-21和miRNA-130a过表达可抑制和下调瘦素受体编码基因(LepR)和早期生长反应因子-3；荧光素酶实验显示LepR是miRNA-21和miRNA-130a的直接目标；miRNA-21和miRNA-130a都能在急性皮肤创伤模型中延迟上皮形成。

3.1.2 miRNA-31

Li等[25]研究认为，miRNA-31能促进伤口愈合过程中人原代角质形成细胞分化增殖和迁移。在人体创面模型中，从炎症阶段至增殖阶段创面边缘的角质细胞miRNA-31表达上调。抑制miRNA-31则会抑制人原代角质形成细胞分化增殖和迁移。此外，上皮细胞膜蛋白(EMP)-1是miRNA-31的靶蛋白之一，沉默EMP-1可造成与miRNA-31过表达的类似效果，而TGF-β2能上调miRNA-31的表达。

3.1.3 miRNA-99与miRNA-100

Jin等[72]对HaCaT细胞进行研究，将其分为实验组和对照组，实验组予以异位转染miRNA-99a、miRNA-99b和miRNA-100，对照组不予转染，结果发现与对照组相比，实验组细胞增殖和迁移极大下调且有63个miRNA表达水平发生改变(P<0.05)。

3.1.4 miRNA-210

Fasanaro等[33]研究发现，HaCaT细胞模型中HIF-1α的存在能引起E2F3衰减，并提出HIF-1α通过依赖miRNA-210通路下调E2F3，HIF-1α可促进miRNA-210翻译，将miRNA-210下调至基础水平以下会极大提高细胞增殖能力；在角质形成细胞中，HIF-1α能促进 miRNA-210表达，从而通过E2F3发挥减弱细胞增殖的能力。

3.1.5 miRNA-483-3p

Bertero等[32]研究发现，被刮伤的人角质形成细胞模型中受损的人角质形成细胞miRNA-483-3p表达上调，这个效应在伤后15 h开始增加，24～72 h达到顶峰(约为正常人角质形成细胞中的6～8倍)；显微镜下，创面在伤后24 h完全关闭，因此提出miRNA-483-3p增加可能在伤口关闭最后阶段起作用的假设。

3.1.6 miRNA-21

Yang等[23]研究发现，在刮伤的人角质形成细胞模型中敲低内源性miRNA-21可导致TGF-β1减少、角质细胞迁移和再上皮化减弱。这进一步说明miRNA-21是TGF-β驱动的伤口愈合过程中重要一环。

3.2 体内实验

3.2.1 miRNA-27b

Wang等[73]对2型糖尿病db/db小鼠和db/+小鼠进行研究，发现2型糖尿病db/db 小鼠的骨髓源性血管生成细胞(BMAC) miRNA-27b表达降低，且细胞内miRNA-27b模拟可促进BMAC的成血管功能；miRNA-276对糖尿病创面的BMAC有局部细胞治疗效果，而对于非糖尿病创面BMAC，抑制miRNA-27b会引起小鼠伤口愈合减缓。以上研究表明，局部miRNA-27b可改善糖尿病小鼠伤口愈合情况。

3.2.2 miRNA-146a

Xu等[74]对比2型糖尿病db/db小鼠和 db/+小鼠创面模型中miRNA-146a与其靶基因表达情况，发现2型糖尿病db/db小鼠创面中miRNA-146a表达明显下调与促炎基因的表达增加相关，miRNA-146a表达增加能减少促炎基因的表达且利于创面愈合。

3.2.3 miRNA-155

van Solingen等[75]对小鼠创面模型进行研究，发现创面处miRNA-155表达高于正常组织；与野生型小鼠相比，miRNA-155基因敲除小鼠伤口闭合能力更强；应用IL-4敲除miRNA-155基因的小鼠炎症区域1基因表达增加是Ⅰ型胶原沉积和伤口愈合过程中的关键。

3.2.4 miRNA-378a

Tang等[76]对miRNA-378a转基因小鼠创面模型进行研究，发现与野生小鼠相比，miRNA-378a转基因小鼠伤口愈合能力更强，伤后第6天伤口更小，这是由于波形蛋白和B3整联蛋白在转基因小鼠中的表达上调，而miRNA-378a表达下调，导致成纤维细胞增殖分化和血管新生速度加快，最终促进伤口愈合。

4 展望

人类基因组大部分为非编码，因此miRNA是新研究热点。miRNA调控创面愈合过程各阶段，包括炎症反应阶段、细胞增殖阶段和组织重建阶段等。在创面愈合甚至许多其他疾病中，miRNA扮演着重要角色。虽然部分miRNA的作用机制已经明确，但这只是人体内miRNA非常小的一部分。理解和识别特定的miRNA及其作用靶点有助于发现潜在的治疗伤口愈合的新方式。miRNA作为新兴药物靶点有许多优势。首先，miRNA分子量很小且序列保守；其次，单一miRNA直接影响下游基因可引起一系列细胞效应及信号级联放大机制。以上表明1个miRNA表达的改变可能会通过下游靶基因对细胞功能产生巨大影响。

miRNA不能通过脂质细胞膜，将其运送至靶细胞内需克服的障碍包括细胞对RNA的低摄取、细胞胞吐作用、核酸免疫原性、miRNA在血液中退化变性以及肾脏清除作用[77]。miRNA起作用必须将其运送至靶器官细胞内，并成为活化形态与胞内目标结合。目前已知的运送方法有通过RNA寡核苷酸与亲脂性分子结合运送、通过静脉注射antagomiR(一类胆固醇共轭单链RNA分子，与成熟的靶向miRNA互补，可以特异且有效抑制miRNA表达)、通过锁核酸修饰的寡核苷酸运送和表达载体运送[78]。因此，现阶段大量研究都是探索如何高效地运送这些miRNA，测试miRNA安全剂量以免出现不可预测的不良反应，尚需进一步研究。目前miRNA运送效率以及RNA抗体产生是miRNA应用的关键限制，使miRNA在靶细胞内达到有效浓度来发挥作用是一项巨大的挑战。随着科学研究的发展，相信将来以miRNA为基础的治疗能为慢性难愈创面患者带来个性化治疗，并减轻医疗负担。

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(收稿：2016-07-25；修回：2016-08-11)

(本文编辑：李圆圆)

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