头孢噻肟钠、转铁蛋白相互作用的光谱特征

崔萌萌， 刘保生， 李彤彤， 段韶彤

(河北大学化学与环境科学学院 河北省分析科学技术重点实验室， 河北 保定 071002)



头孢噻肟钠、转铁蛋白相互作用的光谱特征

崔萌萌， 刘保生*， 李彤彤， 段韶彤

(河北大学化学与环境科学学院 河北省分析科学技术重点实验室， 河北 保定 071002)

将转铁蛋白(TRF)的荧光变化作为研究对象，在298，310，318 K下采用紫外吸收、传统荧光、同步荧光、圆二色谱法，对TRF与头孢噻肟钠(CEM)的结合进行综合分析。数据处理和分析结果显示：TRF的荧光伴随CEM浓度的提高而呈现规律性猝灭，猝灭方式是静态的。两者借助静电作用结合，反应生成新物质。结果的准确性通过上述方法进行了验证。此外，同步荧光和圆二色谱也表明CEM影响了TRF的构象。

作用机制； 转铁蛋白； 光谱法； 头孢噻肟钠

1 引 言

转铁蛋白(Transferrin, TRF)是血浆蛋白质的一类，相对分子量约为80 ku(kDa)，包含679个氨基酸残基，这些氨基酸残基排列在一对相似的结构域，即N端和C端[1]。TRF受体能够在许多癌细胞表面过度表达，因此TRF作为药物载体能够运输多种配体，如金属离子和药物分子[2]。TRF的介导作用可促进药物进入病变细胞，防止对未病变细胞的损伤，增强药物的靶向性，因此TRF常用于研究药物在机体的代谢和运输过程[3]。白蛋白(SA)的研究较多，SA可用于判断机体的营养情况且能快速体现营养检测效果，然而SA在机体的半衰期较长，灵敏度差；TRF于肝处合成，半衰期不长，判断营养状况时TRF灵敏度高，故研究TRF具有医学意义[4]。

头孢噻肟钠(Cefotaxime sodium,CEM)可用于治疗大脑、皮肤、骨骼、胃、呼吸道、耳朵和尿路等的多种感染[5]。CEM是第三代头孢类抗生菌素。早期的头孢菌素不能渗透进中枢神经系统，无法成功治疗脑膜炎；然而第三代头孢菌素能够进入中枢神经系统，因此可以用于治疗革兰氏阴性菌引发的脑膜炎[6]。目前TRF的相关分析不多，没有报道过与CEM的结合。本文借助传统荧光猝灭、紫外吸收、同步荧光以及圆二色谱法来分析TRF、CEM间的作用机制，为以后相关的临床用药以及药理作用带来有价值的理论根据。

2 实 验

2.1 仪器与试剂

仪器：RF-540荧光分光光度计和UV-265紫外可见分光光度计(岛津公司)；MOS-450/SFM300圆二色谱仪(法国Bio-logic)；pHS-3C型精密酸度计(上海雷磁)；CS501超级恒温水浴(南通科学)。

试剂：TRF(Sigma公司)，纯度≥98%，配成浓度为1.0×10-5mol/L的水溶液。CEM，纯度≥98.5%，配成1.0×10-3mol/L的水溶液。Tris-HCl缓冲溶液，pH=7.40，含有0.15 mol/L的NaCl用以维持生理条件下的离子强度。除标注外的试剂均是分析纯。实验用水为二次石英蒸馏水。溶液均在4 ℃下避光保存。

荧光强度值按“内滤光效应”方程[7]校正：

(1)

其中，Fcor和Fobs是校正后和测得的TRF-CEM体系荧光强度，Aex和Aem是CEM在激发和发射波长处的吸光度。

2.2 实验过程

在多个5 mL比色管中顺序加入0.5 mL Tris-HCl缓冲溶液、0.5 mL 2.0×10-6mol/L的TRF以及不同浓度的CEM溶液，定容、摇匀、水浴恒温在298 K下静置40 min。激发波长(λex)为280 nm或295 nm，设置5 nm的狭缝宽度，扫描TRF-CEM体系的荧光光谱。固定波长差Δλ=15 nm以及Δλ=60 nm，记录TRF-CEM体系的同步荧光光谱。温度分别设置在310 K和318 K下重复上述实验。使用1 mm的石英吸收池，测定200～300 nm波长范围内TRF与CEM作用前后的CD谱。在一系列5 mL比色管中加入0.5 mL Tris-HCl缓冲溶液、1.0 mL TRF(1.0×10-5mol/L)溶液及不同浓度的CEM溶液，用二次蒸馏水定容，静置40 min待反应完全。以对应浓度的药物溶液作参比，扫描各体系在190～350 nm的紫外光谱。

3 结果与讨论

3.1 TRF-CEM体系的传统荧光光谱及猝灭机理

图1为CEM的分子结构式，图2为TRF-CEM体系的荧光发射光谱。

图1 头孢噻肟钠的结构式

Fig.1 Chemical structure of CEM

CTRF=2.0×10-7mol/L； 1～10:CCEM= (0, 0.02, 0.4, 0.8, 2.0, 5.0, 8.0, 10, 12, 14)×10-5mol/L .

图2 TRF-CEM体系的荧光发射光谱 (T=298 K,λex=280 nm)

Fig.2 Fluorescence emission spectra of TRF-CEM system (T=298 K,λex=280 nm)

随着CEM溶液的加入以及浓度的增大，TRF的荧光逐渐发生猝灭，说明两者发生了相互结合[8]。实验数据借助斯特恩-沃尔默方程处理[9]：

(2)

方程中F0、F是TRF、TRF-CEM体系的荧光强度，τ0是分子荧光平均寿命(约10-8s)，KSV是猝灭常数，[L]是CEM的浓度，Kq是猝灭速率常数。数据处理结果见表1。表1显示，温度升高则KSV变小，Kq值大于2.0×1010L·mol-1·s-1[10]，说明TRF的荧光猝灭主要是生成化合物而导致的静态猝灭[11]。

表1 不同温度下TRF与CEM的猝灭反应参数

r1为方程F0/F～[L]的线性相关系数；r2为lg(F0-F)/F～lg{[L]-n[Bt](F0-F)/F0}的线性相关系数。

以F0/F对[L]作图(图3)，图中显示随着CEM浓度的增大，3条斯特恩-沃尔默曲线均未偏向纵轴，呈现良好的线性关系，表明不存在动态猝灭。若CEM浓度高时逐渐出现动态猝灭，则表现为曲线渐偏向纵轴[12]。同时，从298 K到310 K再到318 K，曲线斜率逐渐变小，即KSV变小，与表1所显示的数据规律相吻合。

针对静态猝灭，处理数据采用方程[13]：

lg(F0/F-1)=

(3)

可得到Ka(结合常数)和n(结合位点数)。方程中[L]、[Bt]各是CEM、TRF的总浓度。n值设为1，以lg(F0-F)/F～lg{[L]-n[Bt](F0-F)/F0}作图可得大括号外的n值，代入括号内继续作图又可得到一个n值，再将得到的n代入括号内，如此循环计算至括号内外两n值相同。得到的数据列于表1，从表中可得n值近似于1，说明结合位点只有一个。温度降低则Ka值增大说明相互作用生成的复合物的稳定性随温度降低而增大，进而证明TRF-CEM反应过程主要为静态猝灭[14]。

CTRF=2.0×10-7mol/L；CCEM=(2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 9.0, 10, 12, 14)×10-5mol·L .

图3 不同温度下TRF-CEM体系的斯特恩-沃尔默曲线 (λex=280 nm)

Fig.3 Stern-Volmer plots of TRF-CEM system at different temperatures (λex=280 nm)

3.2 TRF-CEM体系的吸收光谱以及结合距离的分析

图4为TRF-CEM体系的吸收光谱。从图4可知，CEM溶液浓度增大则TRF吸光度降低，峰位置红移。该现象表明TRF-CEM体系产生了新的化合物[15]。动态猝灭过程仅改变荧光分子的激发态而不会干扰其吸收谱图，故CEM对TRF的猝灭是静态猝灭[16]。

CTRF=2.0×10-6mol/L； 1～6：CCEM= (0, 0.4, 2.0, 4.0, 8.0, 10)×10-5mol/L .

图4 TRF-CEM体系紫外吸收光谱图 (T=298 K)
Fig.4 UV absorption spectra of TRF-CEM system (T=298 K)

依照福斯特能量转移理论，TRF和CEM之间距离r、能量转移效率E、临界能量转移距离R0(对应E=50%)三者的计算方程[17]为：

(4)

(5)

(6)

其中F0、F分别表示不加CEM、CEM浓度均为2×10-7mol/L时体系的荧光强度；Φ表示仅有TRF的荧光量子产率，取TRF中Trp (Tryptophan 色氨酸) 的量子产率0.118；N表示溶剂的折射率，取1.336；J是TRF的发射光谱与CEM的吸收光谱之间的重叠积分(图5中阴影部分)；K2表示取向因子，取TRF和CEM各向随机分布的平均值2/3；ε(λ)、F(λ)各表示λ处CEM的摩尔吸光系数和TRF的荧光强度。摩尔吸光系数和荧光强度值可借助图5两纵坐标相互换算。在图5阴影部分曲线1、2交点左侧时，ε(λ)、F(λ)分别取曲线2对应的摩尔吸光系数和荧光强度值；在交点右侧时，ε(λ)、F(λ)分别取曲线1对应的摩尔吸光系数和荧光强度值。将所取值代入方程(6) 中即可得J。借助上述3个方程，E、J、R0、r均可得到，列于表2。表2显示：r<7 nm，证明TRF、CEM两者间存在非辐射能量转移[18]；温度降低时，E增大，r减小，TRF与CEM生成的化合物的稳定性增大；r>R0，再次证明CEM、TRF间的反应是静态猝灭过程[16]。

图5 CEM的紫外吸收光谱(1) 和TRF的荧光发射光谱(2) (T=298 K,λex=280 nm)

Fig.5 UV absorption spectra of CEM (1) and fluorescence emission spectra of TRF (2) (T=298 K,λex=280 nm)

表2 不同温度下TRF与CEM间的E、J、r、R0参数

Tab.2 Parameters ofE,J,r,R0between TRF and CEM at different temper atures (λex=280 nm)

T/KE/%J/(cm3·L·mol-1)R0/nmr/nm2987.295.29×10-143.244.943105.495.77×10-143.285.273185.185.28×10-143.235.25

3.3 TRF-CEM体系的作用力分析

借助CEM和TRF相互结合的热力学参数，可判断TRF和CEM的作用力类型。ΔG、ΔS、ΔH间的关系方程[19]为：

(7)

(8)

利用方程(7)、(8)计算热力学参数，列于表3。表中ΔG<0、ΔS>0证明TRF和CEM的反应是熵变大、自由能变小的自发反应。ΔH<0、ΔS>0证明TRF与CEM作用力类型主要是静电引力[19]。

表3 不同温度下TRF-CEM体系的热力学参数(λex=280,295 nm)

3.4 TRF-CEM体系的同步荧光光谱

关于TRF的同步荧光谱图，Δλ=15 nm时体现酪氨酸(Tyr)残基的荧光变化，Δλ=60 nm时体现色氨酸(Trp)残基的荧光变化[20]。TRF-CEM体系的同步荧光光谱见图6。Δλ=15 nm时，荧光发生轻微猝灭和红移；Δλ=60 nm时，荧光发生明显猝灭和红移。该现象说明只有少量的Tyr参加反应，而参加反应的主要是Trp。峰位置移动说明TRF、CEM的相互作用致使Trp和Tyr所在微环境的极性变大，疏水性减小，肽链变得松散，进而改变了TRF的构象[20]。

CTRF=2.0×10-7mol/L; 1～10:CCEM= (0, 0.4, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 9.0, 10, 14)×10-5mol/L .

图6 TRF-CEM体系的同步荧光光谱 (T=298 K)。 (a) Δλ=15 nm; (b)Δλ=60 nm。

Fig.6 Fluorescence spectra of TRF-CEM system (T=298 K). (a) Δλ=15 nm. (b)Δλ=60 nm.

3.5 药物协同性

TRF和CEM结合的协同性可借助Hill方程[21]中的nH来进行分析：

(9)

其中，nH代表Hill系数，K代表结合常数，Y代表反应饱和分数。

(10)

荧光数据处理时：

(11)

其中，1/Qm是1/Q～1/[L]作图所得的截距。将TRF-CEM体系的荧光强度值F代入方程，逐步计算得到相应的Hill系数值，如表4所示。在不同温度下，λex=280 nm和295 nm时nH都近似于1，说明CEM、 TRF的相互作用不会促进也不会抑制后继配体与TRF的作用，即表现为无协同作用[14]。

表4 不同温度下TRF-CEM体系的Hill系数nH(λex=280,295 nm)

Tab.4 Hill coefficient of TRF-CEM systems at different temperatures(λex=280, 295 nm)

T/Kλex=280nmλex=295nmnHr3nHr42981.050.99800.960.99363101.010.98681.020.98553181.030.98511.020.9922

r3、r4为方程lg[Y/(1-Y)]～lg[L]的线性相关系数。

3.6 TRF-CEM体系的圆二色谱分析

圆二色谱(CD)可用以显示蛋白质构象变化。图7是TRF-CEM结合的CD图。211 nm与219 nm附近各存在一个特征峰，为α螺旋的特征峰。CCEM∶CTRF分别为20∶1、30∶1时，负峰高度降低，其位置与形状均无变化，由此显示：α螺旋变松进而致使TRF荧光猝灭，CEM的存在改变了TRF的构象，然而α螺旋依然是其主要结构形式[16]。

CTRF=2.0×10-6mol/L;CCEM=(4.0, 6.0) ×10-5mol/L .

图7 TRF-CEM体系的圆二色谱图

Fig.7 Circular dichroism spectra of TRF-CEM system (T=298 K)

4 结 论

在TRF和CEM的结合中，r<7 nm，表明该过程存在非辐射能量转移。CD图显示CEM影响了TRF的二级结构，致使荧光强度降低，两者的反应对后继配体的反应不存在促进或抑制的作用。TRF与CEM的结合常数Ka显示两者能相互结合。热力学参数显示TRF、CEM的作用依靠静电引力。CEM能被TRF运输，借助血液循环到达作用部位。本研究能对理解药物在机体的分布、转运过程和作用机理提供帮助，对抗感染药物的特定筛选提供参考。

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崔萌萌(1989-),女，山东东营人，硕士研究生，2013年于济宁学院获得学士学位，主要从事分子发光学理论与应用的研究。

E-mail: 1286023098@qq.com刘保生(1963-)，男，河北保定人，硕士，研究员，1992年于河北大学获得硕士学位，主要从事分子发光学理论与应用的研究。

E-mail: lbs@hbu.edu.cn

Spectral Properties of The Interaction Between Transferrin and Cefotaxime Sodium

CUI Meng-meng, LIU Bao-sheng*, LI Tong-tong, DUAN Shao-tong

(KeyLaboratoryofAnalyticalScienceandTechnologyofHebeiProvince,CollegeofChemistry&EnvironmentalScience,HebeiUniversity,Baoding071002,China)

The interaction between transferrin (TRF) and cefotaxime sodium (CEM) at different temperatures (298, 310 and 318 K) was studied by using UV absorption spectroscopy, traditional fluorescence spectroscopy, synchronous fluorescence spectroscopy and circular dichroism spectroscopy. The experiment results indicate that the fluorescence of TRF is regularly quenched with the addition of CEM. The quenching pattern is static. TRF and CEM are combined by electrostatic interaction, and new compound forms during the process. These different methods verify the accuracy and rationality of the results. In addition, synchronous fluorescence spectroscopy and circular dichroism spectroscopy both show the conformation of TRF is influenced by CEM.

interaction mechanism; transferrin; spectroscopy; cefotaxime sodium

1000-7032(2016)11-1415-07

2016-05-10；

2016-06-17

国家自然科学基金(21375032)资助项目

O657.3

A

10.3788/fgxb20163711.1415

*CorrespondingAuthor,E-mail:lbs@hbu.edu.cn