长期耐力训练对大鼠心肌细胞自噬相关因子Beclin1和LC3的影响

马晓雯，常 芸，王世强



长期耐力训练对大鼠心肌细胞自噬相关因子Beclin1和LC3的影响

马晓雯1,2，常 芸1，王世强2

目的：通过实验研究自噬相关因子Beclin1和LC3的表达变化，探讨长期耐力训练对大鼠心肌细胞自噬发生程度的影响，为长期耐力训练诱导自噬的发生机制提供实验依据。方法：选取24只健康雄性SD大鼠，随机分为安静对照组、中等强度训练组和大强度训练组，每组8只。分别以15.2 m/min速度5°坡度和28 m/min速度10°坡度进行16周跑台训练，每周训练5天，每次训练1 h。训练16周后，进行超声心动图检测。取左心室壁用于HE染色，观察心肌组织形态，制备超薄切片进行透射电镜观察，检测自噬发生程度。RT-PCR、Western Blot技术检测大鼠心肌细胞自噬相关基因Beclin1和LC3的mRNA及蛋白表达。数据应用SPSS 19.0统计软件处理，以P<0.05具有显著性差异。结果：1)超声心动图显示，大鼠经过16周跑台训练后，大强度组EF值显著低于对照组(P<0.05)。2)HE染色结果显示，大强度组心肌细胞损伤严重。3)透射电镜检测提示，长时间大强度耐力训练使自噬小体增多，自噬程度增加。4)16周跑台训练后RT-PCR结果提示，自噬相关基因Beclin1和LC3表达水平上调(P<0.05)。5)Western Blot结果表明，与对照组相比，中等强度训练组和大强度训练组Beclin1表达水平及LC3-II/LC3-I比值均显著升高(P<0.05)，且大强度训练组显著高于中等强度训练组(P<0.05)。结论：1)中等强度耐力训练可引起心肌组织细胞良好的适应性重塑，促进心肌细胞适当自噬水平及活性，从而有效上调Beclin1和LC3的表达，提高LC3-II/LC3-I比值，增强心肌细胞代谢能力，有利于心肌能量代谢和收缩功能。2)大强度长时间耐力训练会导致心肌纤维受损，自噬体异常增多，Beclin1和LC3出现过表达的现象，构成心肌细胞损伤的结构与分子病理基础。

心肌细胞；运动强度；Beclin1；LC3

细胞自噬是真核细胞中普遍存在的生命现象，是将细胞内变形、衰老或损伤的蛋白质和细胞器转运到溶酶体腔中消化降解的一种代谢过程[5]。在未接受到外界刺激时，细胞自噬处于较低水平，但营养缺乏、细胞受损或运动等因素会引发细胞自噬发生不同程度的改变。一般来说，适宜强度的运动训练可通过提高骨骼肌、心肌等细胞的自噬水平，降解由于运动刺激所积累的破损和衰老的细胞器、合成或折叠错误的蛋白质，为肌纤维再生提供一定的能量与合成底物，并抑制骨骼肌和心肌细胞凋亡和死亡。但过度训练则会因为细胞自噬的过度激活从而过多降解胞浆中的蛋白质和细胞器，导致骨骼肌和心肌细胞损伤和疲劳，免疫功能下降，甚至诱发自噬性细胞死亡[11，12]。

Beclin1是酵母中Atg6的同源基因,是最早发现的一个自定位到自噬前体的结构中，进而调节自噬活性的调控基因，主要通过与磷酸肌醇三磷酸激酶Ⅲ型PIK形成复合体来调控其他自噬蛋白。Beclin1是参与自噬调控的重要基因，其表达强度与自噬活性密切相关[13，15]。LC3是哺乳动物细胞中酵母Atg8基因的同源物，包括I型与II型[20]。LC3参与两种泛素样蛋白系统的加工修饰过程：新合成的LC3经剪切修饰变成胞浆蛋白LC3-I，之后LC3-I转变为LC3-II，在Atg5协助下定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，参与自噬体的伸展扩张。因此，LC3-II被认为自噬活动的特异性标志物。通常用LC3-II/LC3-I的比值来衡量自噬活性，其比值下降提示自噬活性减弱，反之则说明自噬活性增强[19]。

目前关于运动训练对于心肌细胞自噬的研究受到越来越多的关注，但是，长期耐力训练对心肌细胞自噬及相关自噬因子表达影响的研究还鲜有报道。本研究在建立长时间耐力训练的实验动物模型基础上，观察心肌细胞形态和自噬现象，通过实验研究自噬相关因子Beclin1和LC3的表达变化，探讨长期耐力训练对大鼠心肌细胞自噬发生程度的影响，为长期耐力训练诱导自噬的发生机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SPF级健康雄性SD大鼠24只，体重为220±8 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为[SCXX(京)2012-0001]。所有大鼠均在国家体育总局体育科学研究所ABSL-3级动物房饲养，大鼠常规分笼生活(4只/笼)，标准啮齿类动物饲料(由北京维通利华生物公司提供)饲养，自由饮食，室温为22℃±2℃，空气湿度为45%～55%，每天光照12 h。

1.2 分组和训练方案

1.3 超声心动图测定

在16周大鼠取材前，将其麻醉后仰卧位固定，胸部备皮，小动物超声探头置于大鼠左前胸，连接超声检查仪(SXTCH2.0-1005.0592)进行超声检查。测量左心室后壁舒张期厚度(LVPWD)、左心室后壁收缩期厚度(LVPWS)以及射血分数(EF)。

1.4 取材与样本制备

训练16周后，将全部24只大鼠(安静对照组8只，中等强度训练组8只，大强度训练组8只)进行超声心动图检测和取材。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(40 mg/100 g体重)麻醉后进行超声心动图检测。开胸后迅速摘取心脏，取心尖处1 mm3小块放入固定液，用于电镜检测。切取左心室壁，经多聚甲醛固定后用于制作石蜡切片。组织经石蜡包埋后，于石蜡切片机切取6 μm厚的石蜡切片待用。

1.4.1 心肌组织学样本制备

将大鼠心室肌组织石蜡切片依次经脱蜡、水化、苏木素染色、分化、反蓝、伊红染色、脱水、透明、封片，制成HE染色切片。置于光学显微镜下观察、采图。

1.4.2 心肌细胞形态学样本制备

取大鼠左心室心尖部组织体积约1 mm3大小，4℃戊二醛磷酸缓冲液固定液固定24 h。常规脱水、浸透、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，透射电镜(HITACHIH-7650)下观察心肌组织超微结构变化及自噬体的形成。

1.5 RT-PCR检测Beclin1和LC3 mRNA表达

所有基因引物均参照GeneBank数据库，并由上海生工生物有限公司设计并合成。引物序列如下：Beclin1-F：CGTGGAGAAAGGCAAGATT，Beclin1-R：AGAACTGTGAGGACACCCAAG,产物长度152 bp；LC3-F:GACCCTCTACGATGCTGGTG，LC3-R:TGCTGTCCTCAATGTCCTTCT,产物长143 bp；β-actin-F:CATTGCTGACAGGATGCAGAAG-3，β-actin-R:GAGCCACCAATCCACACAGAGT-3,产物长度150 bp。

RT-PCR检测过程：采用Trizol法提取总RNA，每个样本按照2 μg RNA作为初始模板，配置20 μl的总反应体系，应用cDNA合成试剂盒(High Capacity RNA-to-cDNA Kit，美国ABI)在核酸扩增仪(Gene Amp PCR System 9700，美国ABI公司)进行反转录成cDNA。以合成的cDNA作为模板，以β-actin作为内参，配置20 μl反应体系，每个样本3个复孔，使用荧光定量试剂盒(TaKaRa，RR820A)在实时荧光定量PCR系统(7 300，美国ABI)进行荧光定量，反应条件为：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，40个循环。将荧光定量RT-PCR所得数据用2-△△Ct法进行相对定量，其中，△△Ct=(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参基因)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因)。

1.6 Western Blot检测

提取总蛋白后用BCA法测定并调整蛋白浓度一致，加入蛋白上样缓冲液，沸水中煮10 min使蛋白变性，5%脱脂奶粉(购于美国BD公司)封闭1 h，一抗(Anti-Beclin1和Anti-LC3稀释比例分别为1∶2 000和1∶400，一抗购于美国Abcam公司)置于摇床4℃过夜。TBST洗涤3次，每次5 min，加HRP标记的二抗(1∶4 000，购于北京欣博盛公司)，室温摇床孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，将条带置于化学发光成像系统(BIO-RAD，ChemiDoc Touch)滴加ECL化学发光试剂(购于美国Millipore)进行曝光，条带运用quantity one软件进行图像分析，计算目的蛋白与内参蛋白条带灰度值。内参为β-actin(购于北京欣博盛公司)。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠超声心动图结果

大鼠进行16周跑台训练后，安静对照组、中等强度训练组和大强度训练组间LVPWD、LVPWS无显著性差异，中等强度训练组与对照组EF值无显著性差异，而大强度组EF值显著低于对照组(P<0.05,表1)。

表1 超声心动图检测结果一览表

时间(周)nLVPWD(mm)LVPWS(mm)EF(%)C组1681.08±0.191.33±0.2461.4±4.1M组1681.17±0.321.36±0.2465.0±3.9H组1681.00±0.191.16±0.2652.1±8.0*

注：不同训练强度比较，*P<0.05。

2.2 心脏组织形态改变

大鼠训练16周后：对照组心肌细胞排列整齐，横纹清晰，细胞外间质较少；中等强度组7只大鼠心肌细胞排列稍紊乱，细胞间隙增大，横纹模糊；大强度组8只大鼠心肌细胞肥大，排列紊乱，细胞核增大，细胞间隙增大，横纹消失，部分肌纤维断裂(图1)。

图1 大鼠左心室壁心肌纤维HE染色结果(×400)

2.3 心肌细胞形态改变

大鼠经过16周的训练，对照组心肌细胞排列整齐，明暗带清晰，Z线完整；中等强度组8只大鼠心肌细胞形态基本正常，肌原纤维偶有挛缩，线粒体数量增加，偶见双层膜结构；大强度组7只大鼠肌原纤维断裂，甚至缺失；线粒体增多聚集，形态变异，线粒体嵴断裂、消失，电子密度增加，线粒体被细胞膜包裹形成双层膜结构，自噬程度增强(图2、图3箭头所指处)。

图2 大鼠心肌透射电镜结果—肌纤维和线粒体变化(×2 000)

图3 大鼠心肌透射电镜结果—自噬程度变化(×2 000)

2.4 运动对左心室Beclin1和LC3 mRNA的影响

16周中等强度和大强度训练都促进了大鼠左心房Beclin1 mRNA的表达，且与对照组相比差异具有显著性(P<0.05，图4A)。同时，16周的长时间耐力训练也显著提高了大鼠左心室LC3 mRNA的表达(P<0.01，图4B)，且大强度训练组显著高于中等强度训练组(P<0.01)。

图4 各组大鼠左心室Beclin1和LC3相对表达变化

注：*P<0.05，与对照组比较；**P<0.01，与对照组比较。

2.5 运动对左心室Beclin1和LC3蛋白表达的影响

与对照组相比，中等强度训练组和大强度训练组Beclin1蛋白表达显著升高(P<0.05)，且大强度训练组显著高于中等强度训练组(P<0.01，图5A)。

中等强度训练组和大强度训练组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著高于对照组(P<0.05)，且大强度训练组显著高于中等强度训练组(P<0.01，图5B)。

3 讨论

3.1 长时间耐力训练后心脏大体结构与功能的改变

图5 各组大鼠左心室Beclin1和LC3蛋白的表达变化

注：*P<0.05，与对照组比较；**P<0.01，与对照组比较。

超声心动图(Ultrasonic cardiogramgraph，UCG)是临床检测心功能最常用的无创性技术，通过UCG中计算左心室后壁舒张期厚度(LVPWD)、左心室后壁收缩期厚度(LVPWS)、射血分数(EF)，可以定量检测心脏结构功能状态[17]。本研究发现，大鼠进行16周跑台训练后，安静对照组、中等强度训练组和大强度训练组间LVPWD、LVPWS无显著性差异，中等强度训练组EF值略高于对照组，但二者并无显著性差异，而大强度组EF值显著低于对照组(P<0.05)。这可能是由于中等强度训练对大鼠左心室属于适应性刺激，不足以产生结构和功能的改变。Babette M等研究发现，长期运动训练导致运动员心脏做功效率高，功能储备强，一般安静时EF值较普通人大，这与本实验结果一致。胡继明等[1]的研究也发现，运动员的心脏收缩舒张功能均好于对照组，有氧运动可以提高每搏输出量及射血分数，从而使心脏得到良好的适应性及较强的储备能力。这可能是由于中等强度对大鼠左心室供血能力属于适宜刺激强度，中等跑台训练增强了左心室射血能力，保障肌体供血充足。本研究中大鼠经过16周大强度跑台训练后，EF值并未与中等强度运动组保持相同的上升趋势，反而显著低于对照组(P<0.05)，可能与长时间大强度的训练造成心肌组织细胞结构损伤有关，导致心肌射血功能下降。

3.2 长时间耐力训练后心肌细胞形态与自噬发生程度的改变

经过对左心室壁石蜡切片HE 染色发现，大鼠训练16周后：对照组心肌细胞排列整齐，横纹清晰，细胞外间质较少；中等强度组心肌细胞排列稍紊乱，细胞间隙增大，横纹模糊；大强度组心肌细胞肥大，排列紊乱，细胞核增大，细胞间隙增大，横纹消失，肌纤维断裂。孙晓娟等[6]在对60只SD大鼠进行8周不同强度跑台训练后发现，对照组和低强度组大鼠心肌纤维结构正常，心肌纤维结构清晰，着色均匀；中等强度运动组心肌纤维无明显形态结构的改变；大强度运动组心肌纤维可见明显结构异常和缺血缺氧的改变，并伴有不同程度的细胞浊肿和局限性间质水肿等改变。刘泽广等[4]通过比较大强度运动组和对照组大鼠心肌纤维形态发现，大强度运动组大鼠心肌纤维可见形态异常，着色不均匀，细胞边界模糊不清，细胞排列不整齐。由此可见，大强度运动会导致心肌纤维心态结构异常，这也构成了心肌损伤的结构基础。

自噬是一种物种进化过程中高度保守的代谢机制[18]，而自噬体是一种包绕变性、衰老大分子物质及受损、废用细胞器的双层膜结构。半个世纪前，科学家就已经借助电镜观察到了自噬体结构，此后，免疫荧光、冷蚀刻、蛋白印迹等检测自噬发生程度的研究方法应运而生。目前，应用透射电镜动态观察自噬体的形成是检测自噬发生的金标准[16]。本研究通过透射电镜观察肌纤维、线粒体和自噬程度变化发现：大鼠经过16周的训练，对照组心肌细胞排列整齐，明暗带清晰，Z线完整；中等强度组心肌细胞形态基本正常，肌原纤维偶有挛缩，线粒体数量增加，偶见双层膜结构；大强度组肌原纤维断裂，甚至缺失；线粒体增多聚集，形态变异，线粒体嵴断裂、消失，电子密度增加，线粒体被细胞膜包裹形成双层膜结构，自噬程度增强。现有研究表明，适宜强度的训练可以上调心肌细胞的自噬水平，维持细胞稳态，减少细胞凋亡。本实验大强度组自噬程度的变化趋势与Campos Munoz A[10]研究结果基本一致。

3.3 长时间耐力训练后心肌细胞自噬因子Beclin1和LC3表达的改变

作为分化再生能力有限的心肌细胞，细胞自噬可以作为其促进物质循环以及细胞自我更新的途径之一，所以，心肌细胞自噬对于维持心脏功能和活力具有重要的作用[3]。Beclin1是最早自定位在自噬前体的结构中，被认为可以调控自噬的基因。而LC3，尤其是LC3-Ⅱ表达量的检测也是目前大多数自噬研究所采用的方法。当自噬发生时，LC3-Ⅰ转化成LC3-Ⅱ，定位在自噬体膜上。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和LC3-Ⅱ的多少与自噬发生程度成正相关。本研究中，16周中等强度训练和大强度训练均显著提高了大鼠左心房自噬因子Beclin1、LC3 mRNA和蛋白的表达。贾少辉等[2]研究发现，小鼠进行自由转轮、游泳和跑台运动8周后，3种运动方式均能提高Beclin1的表达，且游泳和跑台运动提高的幅度更大。有研究表明，梯度跑台运动6周后，衰老大鼠运动组和对照组相比，Beclin1表达增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加，提示，运动可上调衰老大鼠心肌细胞自噬水平，从而减缓心肌细胞的衰老过程，减轻老龄心肌细胞损伤，改善老龄大鼠心脏功能[8]。Lira VA等[14]研究也发现，4周跑步训练可增加基底自噬流量，同时，也上调LC3-Ⅱ、Beclin1的表达水平，也使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，这与本研究结果一致。由此可见，运动刺激可通过上调自噬水平，增强降解细胞内代谢废物的能力，减少细胞损伤，从而维持细胞的稳定状态。

本研究结果值得关注的是，大鼠运动16周后，不但运动组心肌细胞自噬因子Beclin1和LC3的表达升高，且大强度训练组显著高于中等强度训练组，这可能与长期大强度运动会引起心肌细胞自噬过度激活有关。Feng等[11]研究发现，过度训练可使肌肉萎缩，自噬相关基因Beclinl、LC3表达显著增加，并因此认为过度训练可引起细胞自噬的过度激活，从而过多降解骨骼肌细胞质中的蛋白质和细胞器(线粒体、内质网)等主要成分，使肌肉发生萎缩，肌肉能力下降，细胞免疫功能降低。也有研究显示，超负荷训练可使心肌细胞自噬被过度激活，加速心肌细胞死亡，同时也加快了心肌细胞产生实质性损伤的速度[7]。

4 结论

1.中等强度耐力训练可引起心肌组织细胞良好的适应性重塑，促进心肌细胞适当自噬水平及活性，从而有效上调Beclin1和LC3的表达，提高LC3-II/LC3-I比值，增强心肌细胞代谢能力，有利于心肌能量代谢和收缩功能。

2.大强度长时间耐力训练会导致心肌纤维受损，自噬体异常增多，Beclin1和LC3出现过表达的现象，构成心肌细胞损伤的结构与分子病理基础。

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Effects of Long-term Endurance Training on Autophagy-related Factors Beclin1 and LC3 of Rat Cardiomyocytes

MA Xiao-wen1,2,CHANG Yun1,WANG Shi-qiang2

Objective:Through experimental research of expression changes on autophagy -related factors Beclin1 and LC3,this paper explores the influence of long-term endurance training on the degree of rat cardiomyocyte autophagy,and in order to provides experimental evidence for the long-term endurance training inducing mechanism of autophagy.Methods:Select 24 SD rats were grouped to control group,moderate intensity group and high instensity group with 8 animals in each group.Respectively does 16 weeks treadmill training on 15.2m / min speed of 5° slope and 28m / min speed of 10° slope,5 days/weeks,1h/day.Make detection of echocardiography after 16 weeks training.Left ventricular wall used in HE staining,observe the myocardial tissue,preparation of ultrathin slices for transmission electron microscope,testing level of autophagy.Use RT-PCR,Western Blot to detect autophagy-related genes Beclin1 and LC3 mRNA and protein expression of rat cardiomyocytes.Results:1) Echocardiography showed that,after 16 weeks treadmill training,high intensity group EF value is lower than control group(P<0.05);2) HE staining results showed that,high intensive group of myocardial cell injury is serious;3) TEM analysis suggests that long terms high intensity endurance training increased degree of autophagy;4) After 16 weeks training,RT-PCR results that the expression of autophagy-related genes Beclin1 and LC3 was raised;5) Western Blot suggests that,compair with control group,both moderate intensity group and high instensity group,the expression of Beclin1and LC3-II / LC3-I ratio was significantly increased (P<0.05),and high intensity training group was significantly higher than moderate intensity training group (P<0.05).Conclusion:1) Mderate intensity endurance exercise can cause cardiac tissue good adaptability remodeling,promote appropriate levels of autophagy and activity of myocardial cells,which effectively increases the expression of Beclin1 and LC3 and improve LC3-II / LC3-I ratio,increase cardiac cells metabolism,and in favor of myocardial energy metabolism and contractile function;2) High intensity endurance exercise can cause myocardial fiber damaged,autophagy abnormal increased,Beclin1 and LC3 over-expressed,and form the structure and basis of the molecular pathology of myocardial cell injury.

myocardialcells;exerciseintensity;Beclin1;LC3

1000-677X(2016)02-0066-06

10.16469/j.css.201602008

2015-08-21；

2016-01-21

国家体育总局体育科学研究所基本科研业务费资助项目(14-01)。

马晓雯(1989-)，女，北京人，在读硕士研究生，主要研究方向为运动心脏生理和病理，Tel：(010)87182567，E-mail：1219104640@qq.com；常芸(1957-)，女，内蒙古人，研究员，博士，博士研究生导师，主要研究方向为运动员心脏病生理与医务监督，Tel：(010)87182526，E-mail：changyun@ciss.cn；王世强(1987-)，男，山东济宁人，在读博士研究生，主要研究方向为运动心脏生理和病理。

1.国家体育总局体育科学研究所，北京 100061；2.上海体育学院 运动科学学院，上海 200438 1.China Institute of Sports Science，Beijing 100061，China.2.Shanghai University of Sport，Shanghai 200438， China.

G804.2

A