翻译后修饰蛋白质组学分离方法的研究进展

许静静, 刘 幸, 周 虎*

(1. 中国科学院上海药物研究所分析化学研究室, 上海 201203;2. 上海市食品药品检验所化学药品室, 上海 201203)



翻译后修饰蛋白质组学分离方法的研究进展

许静静1,2, 刘 幸1, 周 虎1*

(1. 中国科学院上海药物研究所分析化学研究室, 上海 201203;2. 上海市食品药品检验所化学药品室, 上海 201203)

蛋白质翻译后修饰(PTMs)是调节细胞内生理活动的重要途径。该文总结了近年来PTMs蛋白质组学相关的分离方法,包括反相(RP)色谱法、离子交换(IEX)色谱法、亲水相互作用色谱(HILIC)法、多孔石墨化碳(PGC)色谱法、毛细管电泳(CE)法及分子筛色谱(SEC)法等。这些新方法为磷酸化、乙酰化、糖基化等PTM肽段或蛋白质的鉴定提供了更高的分离度和灵敏度。此外,该文也介绍了蛋白质领域其他重要分离方法的研究进展,这些方法可能被进一步应用于PTMs蛋白质组学的研究中。

翻译后修饰;蛋白质组学;反相色谱;离子交换色谱;亲水相互作用色谱;多孔石墨化碳色谱;毛细管电泳

蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs)是细胞实现快速、可逆调控蛋白质功能的关键途径。哺乳动物中超过50%的蛋白质需经PTMs才能实现其特定的生理功能[1]。目前,Uniprot蛋白质数据库已收录超过450种PTMs蛋白质的类型[2],其中最主要的PTMs包括磷酸化、赖氨酸乙酰化、泛素化、糖基化、蛋白酶水解、甲基化等。PTMs蛋白质组学的研究流程与经典蛋白质组学相似,但由于PTMs的蛋白质相对丰度较低,在细胞内处于动态变化中,并且修饰基团与氨基酸残基间的共价键较易断裂,所以PTMs蛋白质组学的研究需要更加有效的分析技术。PTMs蛋白质组学研究一般包括样品前处理、肽段分级、含修饰基团肽段的富集、质谱分析、生物信息学分析等步骤。在过去几年里,许多新的离线/在线肽段/蛋白质分离方法被提出,为PTMs蛋白质组学提供了有力的技术支持。本文主要对近几年PTMs蛋白质组学分离方法的新进展进行综述。

1 磷酸化蛋白质组学分离方法

1.1 高pH反相色谱在磷酸化肽段分离中的应用

Gilar等[3]首次将高pH反相-高效液相色谱(RP-HPLC)用于肽段分级,建立了用于蛋白质组学分析的二维RP-RP-HPLC-MS/MS法,并获得了很好的正交性。第一维C18反相色谱流动相的pH为10、第二维的pH为2.6。高pH RP-HPLC法与传统的强阳离子交换(SCX)-HPLC法相比,具有分辨率高、质谱兼容性好的优点。Song等[4]在此研究的基础上,改变了第一维分级组分的混合方法,把分离时间均分成前后两段,将时间间隔相同的两个时间段内的组分混合,提高了二维RP-RP-HPLC-MS/MS法的正交性,鉴定得到磷酸化肽段的数目提高了30%。经RP-HPLC-线性离子阱质谱分析,在人肝磷酸化蛋白质组中检测到约8 000个磷酸化位点。Wang等[5]将二维RP-RP-LC-MS/MS法与传统SCX-RP-LC-MS/MS法比较,发现RP-RP-LC-MS/MS法鉴定到的肽段和蛋白质数目分别是SCX-RP-LC-MS/MS法的1.8倍和1.6倍。

1.2 含多个磷酸化位点肽段的分离方法

静电斥力-亲水作用色谱(ERLIC)法采用弱阴离子交换固定相,通过降低流动相中有机溶剂比例和pH值进行洗脱,肽段根据其等电点(pI)和极性高低顺序依次被洗脱。洗脱初始阶段,流动相中有机溶剂的比例较高,肽段的保留主要依赖亲水相互作用,随着有机溶剂比例的降低,静电相互作用逐渐成为主导[6]。在磷酸化修饰分析中,将ERLIC、亲水相互作用色谱(HILIC)及SCX色谱分别与二氧化钛(TiO2)富集法结合,并比较这3种方法的鉴定结果。SCX-TiO2法鉴定到的磷酸化肽段最多,而对于含有3个以上磷酸化位点肽段的鉴定,ERLIC-TiO2法最佳[7]。

含有3个以上磷酸化位点的肽段具有多个磷酸化位点,所带负电荷多、正电荷少,采用ERLIC法富集时,其保留较强；而采用SCX色谱法富集时，其难以保留,所以鉴定得到的多为仅含有1个磷酸化位点的肽段，两种方法具有互补性。Zarei等[8]将SCX色谱法和ERLIC法相结合对磷酸化肽段进行检测,在相同时间内鉴定到更多的磷酸化位点和肽段。与单独使用SCX色谱法相比,SCX-ERLIC-MS/MS法和ERLIC-SCX-MS/MS法鉴定得到含有3个以上磷酸化位点的肽段的数目增加了50%和40%,鉴定得到的含有1～2个磷酸化位点的肽段数目也更多。

将超高效液相色谱(UPLC)应用于蛋白质组学的分析可以提高色谱分辨率、检测灵敏度及分析速度。然而Fleitz等[9]发现采用UPLC法分析磷酸化肽段(尤其是含多个磷酸化位点的肽段)时比采用HPLC法更容易“丢失”。磷酸化肽段-金属离子复合物的形成是造成磷酸化肽段分析困难的重要原因之一。Fleitz等[9]建立了经EDTA处理的二维反相和纳流超高效液相色谱(RP-RP-nanoUPLC)系统,提高了多磷酸化位点肽段的鉴定率。他们发现采用RP-nanoUPLC-MS/MS法检测含有3个磷酸化位点的标准肽段时,即使用EDTA-Na2溶液对色谱柱或样品进行预处理,仍无法检测出该标准肽段。以α-酪蛋白(α-casein)和β-酪蛋白(β-casein)酶解产物为例,比较EDTA-RP-nanoUPLC-MS/MS、RP-RP-nanoUPLC-MS/MS和EDTA-RP-RP-nanoUPLC-MS/MS 3种方法对磷酸化肽段的鉴定能力,前两种方法未鉴定到任何含有3～4个磷酸化位点的肽段,而EDTA-RP-RP-nanoUPLC-MS/MS法在α-casein中测得13种含单一磷酸化位点、6种含两个磷酸位点和3种含3个磷酸化位点的肽段,在β-casein中测得19种含单磷酸化位点、8种含两个磷酸化位点、4种含3个磷酸化位点及3种含4个磷酸化位点的肽段。采用该方法对500 μg包皮纤维原细胞总蛋白酶解产物进行分析,测得1 087种磷酸化蛋白质、1 944种磷酸化肽段、2 164种可信磷酸化位点,79%的磷酸化肽段中含单一磷酸化位点、20%含两个磷酸化位点、约1%含3～4个磷酸化位点,其中78个位点为人蛋白质中首次发现的全新磷酸化位点。该方法在磷酸化蛋白质的鉴定中十分有效,尤其提高了含多个磷酸化位点的蛋白质的鉴定率。该方法已成为该实验室磷酸化分析的标准方法,并且成功应用于人单核细胞膜定量磷酸化蛋白质组学分析和酪氨酸受体酪氨酸磷酸化蛋白质组的项目研究中。

Batth等[10]对离线RP-RP-LC-MS/MS方法进行优化,样品经第一维高pH反相色谱分级后,采用两次TiO2富集,然后进行纳流液相色谱-串联四级杆静电场轨道阱质谱(nanoLC-Q-Orbitrap/MS, Q-Exactive)检测。以小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH-3T3)磷酸化蛋白质组为例,得到了30 000多种磷酸化肽段,超过传统SCX-RP-LC-MS/MS法检测结果的2倍。其中,两次TiO2富集提高了多磷酸化位点肽段的鉴定率。

1.3 含多个碱性氨基酸磷酸化肽段的分离方法

SCX色谱法是经典的肽段分级方法,胰酶酶解肽段在低pH条件下上样,采用盐梯度或pH梯度进行洗脱。在进行磷酸化肽段分级时,含有碱性氨基酸残基的磷酸化肽段难以有效分离。Gauci等[11]对SCX色谱法进行优化后,能够将单一磷酸化修饰和多磷酸化修饰的肽段分离。为将含有多个碱性氨基酸残基的磷酸化肽段与非磷酸化肽段分离,Hennrich等[12]建立了不同pH条件(pH 3和pH 1)洗脱的SCX-SCX-LC-MS/MS法。为证明该方法的可行性,他们首先在pH 1条件下,验证了各种肽段能够稳定存在;同时对该系统在pH 1条件下的分离能力进行了考察,该方法使用了能耐受强酸性条件的商品化LC仪和SCX色谱柱,其分离能力几乎不受pH值的影响,其半峰高处的全峰宽(FWHM)约为0.6 min。在该方法中,第一维分离的pH值为3,此时,磷酸基团解离为负离子形式,由于肽段的保留主要与肽段所带的净正电荷相关,所以洗脱顺序依次为含有多个磷酸化修饰位点的肽段、N-乙酰化肽段、单磷酸化修饰的肽段和含有多个碱性氨基酸的肽段。取第一维色谱分离得到的含有多个碱性氨基酸的肽段混合物,进行第二维分离。第二维色谱采用pH 1的洗脱液,此时,由于磷酸基团不解离,呈电中性,所以含有磷酸化修饰的肽段所带净正电荷提高;而不含磷酸化修饰的肽段先被洗脱,磷酸化肽段后被洗脱。他们将该SCX-SCX-LC法和RP-nanoLC-MS/MS法联合用于分析人宫颈癌细胞(Hela)提取蛋白,得到31 000种非磷酸化肽段和10 000多种含2个及以上碱性氨基酸的磷酸化肽段。等量肽段在pH 3条件下经一维SCX色谱法分离后,直接采用RP-nanoLC-MS/MS法检测,仅得到18 500种肽段和不足550种的磷酸化肽段。可以看出,其检测结果提高了约20倍。将此方法与其他传统的SCX色谱法结合[11,13,14]可以较全面地对磷酸化肽段进行检测。

1.4 相对分子质量较低的磷酸化肽段的分离方法

毛细管电泳(CE)法分辨率较高,但由于载样量小、鞘液稀释等问题导致灵敏度较低,与ESI-MS/MS联用时易受到限制。近年来许多提高CE载样量和灵敏度的新技术被提出,其中采用多孔无鞘接口与ESI-MS/MS联用的方法已成功应用于肽段和蛋白质的鉴定[15]。Faserl等[16]将多孔无鞘接口与Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL质谱仪连接,采用外壳带正电的毛细管柱和低pH背景溶液(BGE),考察了该方法的系统适应性。研究表明该系统性能主要取决于毛细管喷头与质谱入口间的距离、喷雾电压、样品溶液的浓度及电渗流(EOF)强度。通过优化这些参数,可以提高方法的信噪比和灵敏度。以H1组蛋白为样品,他们对CE-ESI-MS/MS法与LC-ESI-MS/MS法的检测能力进行了比较。在相同上样量的情况下,采用CE-ESI-MS/MS法时,色谱分辨率更高、质谱信号更强,鉴定得到的肽段更多(多60%),尤其对于相对分子质量较低的肽段(小于1 400 Da),其序列覆盖率也获得提高。此外,CE-ESI-MS/MS法的分析时间仅为LC-ESI-MS/MS法的1/4。

Sarg等[17]首次采用多孔无鞘CE-ESI-MS/MS技术对组蛋白PTMs进行研究。与nanoLC-ESI-MS/MS法相比,CE-ESI-MS/MS法具有更高的灵敏度,可以鉴定得到更多的磷酸化肽段和磷酸化位点。CE法不存在死体积和共流出离子抑制作用的限制,可以通过降低流速提高其灵敏度。此外,两种方法均鉴定得到一些独有的磷酸化肽段,二者鉴定结果具有较好的互补性。CE-ESI-MS/MS技术在鉴定相对分子质量较低的磷酸化肽段时具有优势,而相对分子质量较高的磷酸化肽段,更易被LC-ESI-MS/MS法鉴定。然而,他们发现组蛋白中的甲基化、泛素化等PTMs并没有被CE-ESI-MS/MS鉴定到,这一问题尚待解决。通过进一步优化,CE-ESI-MS/MS法可以成为LC-ESI-MS/MS法的互补方法,用于多种PTMs的研究。

Faserl等[18]将细胞培养条件下的氨基酸稳定同位素标记技术(SILAC)与超低流速(<10 nL/min)CE-MS/MS法结合,建立了新的超高灵敏度定量蛋白质组学的分析方法。该方法在CE-MS/MS检测前采用RP-LC法对肽段进行分级,使用电中性毛细管外壳,并通过降低流速提高CE的分离效率。将该方法用于酵母细胞定量蛋白质组学的研究中,获得了28 538个定量肽段和3 272个定量蛋白质。通过对CE-MS/MS鉴定得到的1 371个磷酸化肽段进行定量分析,得到49个在2个细胞株中被差异调控的磷酸化肽段。除了磷酸化修饰,还鉴定到乙酰化修饰、氧化修饰、去酰胺修饰等共8 106个PTMs肽段。这种高灵敏度的定量方法可在PTMs研究中发挥重要作用。

2 乙酰化蛋白质组学分离方法

85%的蛋白质在翻译或翻译后发生N端乙酰化修饰,这是最普遍的蛋白质修饰之一[19]。N端乙酰化修饰的分离富集方法,一般可分为反向选择和正向选择两类。反向选择是基于N端自由氨基与其他试剂反应而被去除,相对惰性的α-N-乙酰化肽段可以从反应液中被分离富集[20,21]。正向选择是利用α-N-乙酰化肽段的N端氨基不发生质子化,与N端为自由氨基的肽段相比,所带净正电荷少1,从而可以在SCX色谱的流过液中直接得到分离和富集[22]。Chen等[23]采用SCX固相萃取的方法分离富集α-N-乙酰化肽段,通过二甲基化标记自由氨基,扩大了α-N-乙酰化肽段与自由氨基肽段在SCX色谱上的保留时间差异。该方法与其他方法相比,操作简便、快速,与同位素标记定量、二维LC-MS/MS法结合可以用于N端乙酰化蛋白质的定量分析。

含有赖氨酸乙酰化修饰的肽段的富集主要采用特异性抗体进行亲和纯化[24,25]。富集得到的赖氨酸乙酰化修饰肽段经过nanoLC-MS/MS检测,或经高pH反相色谱等分级后,再进行nanoLC-MS/MS检测。

3 糖基化蛋白质组学分离方法

Zhao等[26]将PGC色谱与传统低pH反相色谱结合,用于蛋白质组学和N-糖蛋白的定性和定量分析。他们在小脑颗粒神经元中鉴定得到11 984种肽段序列和2 678种非冗余蛋白质,这是目前得到的最大规模小脑颗粒神经元的蛋白质组学数据。他们通过优化PGC色谱的pH,改善了对疏水性肽段的鉴定条件。在PGC色谱柱和反相色谱柱之间增加一个即插即用的PGC模块,可同时实现对亲水性和疏水性肽段的有效检测。将PGC-RP-LC-MS/MS法用于食蟹猴血浆糖蛋白的分析,得到了130种N-糖基化血浆蛋白、705种N-糖肽和254个糖基化位点。与RP-RP-LC-MS/MS法相比,采用PGC-RP-LC-MS/MS法可以鉴定到更多的亲水性肽段。他们建立的PGC-RP-LC-MS/MS法可成为蛋白质组学和糖蛋白质组学分析中的有效技术。

HILIC固定相表面存在亲水层,采用含高比例有机相的流动相上样,水梯度洗脱,用于极性或亲水性化合物的分离,是重要的糖蛋白及糖肽富集方法[27-29]。Dedvisitsakul等[30]采用键合两性离子基团的亲水相互作用色谱(ZIC-HILIC)法测定糖肽,用棉絮与固相萃取结合,提高了载样量;超速离心式反应器与ERLIC法结合,提高了鉴定率[31,32]。

4 其他方法

4.1 “自顶向下”蛋白质组学分离方法

“自顶向下(Top-down)”蛋白质组学可以从蛋白质的整体角度为PTMs研究提供信息[33-35]。在Top-down蛋白质组学中,首先要将相对分子质量较高和较低的蛋白质分离。分子筛色谱法根据蛋白质的大小或动态水体积对其进行分离。传统分子筛色谱法存在分离度较低、分离后样品被大量稀释等问题,限制了其在蛋白质分离中的应用。Chen等[36]采用UPLC系统,填料粒径为1.7 μm、孔径分别为12.5 nm和20.0 nm的分子筛色谱柱,使用与质谱兼容的挥发性溶剂,建立了分离度高、分析速度快的分子筛色谱法,该方法能够实现对6～669 kg/mol范围内的蛋白质的快速分离。该方法在翻译后蛋白质组学中的应用有待进一步开发。

Han等[37]将在线无鞘CE-ESI-MS/MS(Orbitrap Elite)法用于Top-down蛋白质组学中,并对强烈炙热球菌的蛋白质组进行分析,得到134种蛋白质和291种蛋白质变体,其中包括乙酰化修饰、二硫键修饰、氧化修饰和糖基化修饰等多种PTMs蛋白质。为CE法在Top-down PTMs蛋白质组学中的应用奠定了基础。

Vorontsov等[38]将“自下而上(Bottom-up)”蛋白质组学与Top-down蛋白质组学结合,用于冰岛硫化叶菌蛋白质组的分析,鉴定得到丰富的赖氨酸甲基化和N段乙酰化修饰肽段。为两种方法结合并用于PTMs蛋白质组学的研究奠定了基础。

4.2 低丰度蛋白质分离方法

为进一步提高RP-RP-LC-MS/MS法的灵敏度,Zhou等[39]采用高pH的RP-LC(pH 10)、高pH的强阴离子交换色谱(SAX)(pH 10)、低pH的RP-LC(pH 3)的自动化在线三维LC-MS/MS法对复杂蛋白质组样品进行分离。以大肠杆菌总蛋白胰酶的酶解产物为例,与RP-RP-LC-MS/MS法比较,RP-SAX-RP-LC-MS/MS法鉴定得到的肽段和蛋白质的数目提高了44%和31%。将RP-SAX-RP色谱与离子阱质谱(LCQ)串联,对40 μg酿酒酵母总蛋白质酶解产物进行分析,可检测到表达水平为每个细胞50拷贝的蛋白质,其检测下限约为0.5×10-17mol。将RP-SAX-RP与LTQ-Orbitrap MS串联,对5 μg酵母总蛋白质酶解产物进行分析,测得4 000多种蛋白质,检测下限可以达到0.65×10-17mol。该方法对低丰度蛋白质检测提供了有力的技术支持。Law等[40]将RP-RP色谱法和SCX-RP色谱法相结合,建立了三维RP-SCX-RP-LC-MS/MS法,该方法在鉴定亲水性极强的肽段时具有一定优势。将该方法用于大鼠嗜铬细胞瘤PC12总蛋白质的分析,鉴定得到97 309种肽段和6 345种蛋白质。与RP-RP-LC-MS/MS法相比,可获得较高的蛋白质鉴定率和序列覆盖率,但分析时间较长。由于该方法避开了同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)标记试剂的干扰,提高了iTRAQ定量方法的准确性。

Quan等[41]同时将SAX和SCX色谱结合到RP-RP-LC-MS/MS法中,建立了在线全自动多维RP-SA(C)X-RP-LC-MS/MS的分离方法。肽段经第一维高pH反相色谱分离后,依次经过SAX和SCX色谱分离,最后经低pH反相色谱分离后,进入质谱检测。将该方法用于复杂样品蛋白质组学分析,可获得更高的蛋白质鉴定率和序列覆盖率,同时提高了酸性、亲水性以及疏水性肽段的鉴定率。以食蟹猴脑皮质组织为例,RP-SA(C)X-RP-LC-MS/MS法检测到127种内源性酪氨酸硝基化肽段和137种存在于整合蛋白质中含跨膜结构域的肽段。此外,该方法可以提高定量方法的可信度。

膜蛋白质疏水性强、丰度低,采用LC-MS/MS法对膜蛋白质进行分析时,一般需要大量的原始样品。因此对只有少量临床样本的膜蛋白质组学进行分析时需要更加灵敏的分析技术。Dimayacyac-Esleta等[42]在StageTip中采用高pH反相色谱法对肽段进行第一维分离,考察该方法对膜蛋白质组的鉴定能力及灵敏度。10 μg膜蛋白质酶解产物经高pH反相StageTip法分级后,经RP-nanoLC -静电轨道阱质谱检测,可以得到约5 000种蛋白质,其中膜蛋白约3 000种,分级仅需要15 min,说明采用该方法对膜蛋白进行鉴定具有快速、灵敏的优点。与SAX StageTip及SCX StageTip法进行比较,发现高pH反相StageTip法鉴定得到的含有跨膜螺旋结构域的肽段数目是前两种方法的2倍。他们采用该方法对10 μg Hela细胞膜蛋白酶解肽段进行检测,得到约630种质膜整合蛋白质,这几乎是目前鉴定得到的所有质膜整合蛋白质数目的1/2。人类蛋白质组蓝图中仍然缺失的蛋白质中约30%为膜蛋白质,Kitata等[43]采用高pH反相StageTip法寻找与非小细胞肺癌相关的缺失膜蛋白质。在测得7 702种蛋白质中(约66%为膜蛋白质)发现178种缺失蛋白质(74种为膜蛋白质)。进一步采用多反应监测质谱模式对合成肽段进行检测,验证了8种缺失蛋白质,其中7种包含跨膜螺旋结构域。在高pH反相StageTip法的基础上,用于膜蛋白质PTMs检测的新方法有待进一步开发。

4.3 偏碱性和偏酸性肽段分离方法

传统SCX色谱法采用盐梯度洗脱,流动相与质谱兼容性较差,一般不与质谱直接在线联用,笔者所在实验室采用挥发性酸(丙二酸、甲酸)和挥发性碱(氨水)调节流动相pH,以50%(v/v)乙腈水溶液为流动相,建立了在线直接联用、连续pH梯度洗脱的SCX-LC-MS/MS法,并应用于标准蛋白质和复杂蛋白质的样品分析[44]。与RP-LC-MS/MS法具有较好的互补性,通过结合,可以提高蛋白质鉴定的序列覆盖率;该方法倾向于鉴定更高比例的碱性肽段,在鉴定含组氨酸肽段时具有明显优势。在该方法的基础上,用于组氨酸磷酸化修饰肽段检测的新方法有待进一步开发。

Horie等[45]采用长2 m、经尿素官能团修饰的硅胶亲水相互作用毛细管整体柱与质谱直接在线联用,对Hela细胞总蛋白质酶解产物进行HILIC-LC-MS/MS分析,与采用硅胶-C18毛细管整体柱比较,可鉴定得到数目相当的肽段和蛋白质。此外,HILIC-LC-MS/MS法获得肽段的色谱峰强度约是RP-LC-MS/MS法的5倍,这可能是因为其流动相中乙腈的比例较高,离子化效率较高。HILIC-LC-MS/MS法检测到的偏碱性肽段也更多。该方法可以作为传统反相色谱的补充工具,用于提高蛋白质鉴定的序列覆盖率和研究偏碱性肽段的PTMs。

一般磷酸化肽段富集方法需要大量的蛋白质样品,这限制了磷酸化蛋白质组学在样品量稀少时的临床研究。Loroch等[46]采用ERLIC法对磷酸化肽段进行分级,只需少量蛋白质样品即可获得足量磷酸化肽段。根据分级时的洗脱顺序,选择不同的固相萃取方法(SCX或RP)进一步纯化后,经LC-MS/MS检测。采用该方法对0.1 mg Hela细胞总蛋白质酶解产物进行分析,分析时间为45 h,重复2次,可得到8 998个不同的非冗余磷酸化位点,每次实验均可得到7 500多种非冗余磷酸化位点,共检测到3 013种磷酸化蛋白质。该方法检测蛋白质的动态范围为几拷贝至几千万拷贝。与基于亲和相互作用的Ti4+方法相比,该方法在富集较长和偏酸性的磷酸化肽段时更具优势,利用该方法鉴定得到了327种C端磷酸化肽段。

Hao等[47]建立了多维RP-ERLIC-LC-MS/MS鉴定去氨基化肽段的分析方法。de Jong等[48]在此基础上进行优化,建立了直接在线联用的nanoERLIC-LC-MS/MS法。该方法采用75%(v/v)乙腈溶液作为起始流动相,增大了上样时肽段的溶解度,从而提高了肽段的鉴定率;与传统RP-MS法进行比较,该方法鉴定得到的肽段数目增加了57%,亲水性肽段或酸性肽段在ERLIC色谱中保留更好,该方法在鉴定较长肽段时具有优势。ERLIC-LC-MS/MS法可作为传统RP-LC-MS/MS法的替代方法,用于糖基化修饰和磷酸化修饰的研究。

4.4 离子交换色谱法的创新

在蛋白质组学肽段分级中,SCX色谱法是被广泛使用的传统方法,而SAX色谱法则较少被应用。Ritorto等[49]通过测试疏水性不同的SAX色谱柱,发现了一款肽段分离性能较好的SAX色谱柱,该色谱柱以超大孔树脂为基质、亲水性的烷醇季铵离子为固定相。他们将其称为hSAX (hydrophilic SAX)。

表 1 翻译后修饰蛋白质组学分离新方法

RP: reversed-phase; SCX: strong cation exchang; ERLIC: electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography; PGC: porous graphitic carbon; ZIC-HILIC: zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography.

采用hSAX色谱法对RAW264.7巨噬细胞的酶解产物进行分级,然后经低pH RP-LC-MS/MS检测,最终得到9 469种蛋白质和126 318种肽段。与高pH反相色谱串联低pH RP-LC-MS/MS法相比,hSAX-RP-LC-MS/MS法鉴定得到的蛋白质数目和肽段数目分别增加了10%和28%。这种hSAX色谱为多维LC法提供了新的选择,通过进一步研究,该方法或可应用于定量蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学的分析中。

在20世纪80年代,Rassi和Horvath等[50]提出将强阳离子和弱阴离子交换(anion and cation exchange, ACE)填料混合,建立了分离酸性及碱性蛋白质的方法。但当时“道南平衡理论”[51]并未出现,无法合理解释其保留机制,以致其发展缓滞。Motoyama等[51]将ACE色谱用于多维LC中的第一维肽段分级,与SCX色谱法相比,使用的盐溶液浓度更低,而肽段回收率为其2倍。Mommen等[52]通过研究发现,ACE色谱法中肽段的保留主要与弱阴离子交换(WAX)填料和SCX填料的比例及流动相的离子强度有关。他们将不同比例的两种填料混合,并分析了鉴定得到肽段的pI值等性质,为根据肽段性质选择填料的混合比例提供了参考。他们采用甲酸和二甲基亚砜溶液作为流动相,连续pH梯度洗脱,得到了与醋酸铵盐梯度洗脱方法相当的鉴定水平。此外,由于流动相不含盐,该方法可以与25 μm内径的反相毛细管色谱柱联用,鉴定水平可提高2～3倍。pH梯度洗脱的ACE-RP-LC-MS/MS法灵敏度高,或可成为样品量极少时的有效分析方法。结合ACE色谱法,用于磷酸化等PTMs肽段分离的新方法有待开发。表1总结了PTMs蛋白质组学分离的一些新方法及其具有的优势。

5 结论与展望

近年来,许多新的针对PTMs蛋白质组学的具有高分离能力和高灵敏度的分析方法得到了快速发展,实现了真核细胞中几千至几万种PTMs位点的鉴定和新修饰位点的发现。本文对近几年用于PTMs蛋白质组学的新分离方法进行了综述,并对各种方法创新的应用和优势进行了分析。此外,本文对蛋白质组学领域其他重要的分离方法的研究进展进行了介绍,希望通过改进和创新,这些方法能够成为翻译后修饰蛋白质组学研究的技术支撑。

新的PTMs肽段的特异性富集方法、PTMs蛋白质的绝对定量方法、靶向PTMs蛋白质组学及生物信息学分析方法的发展将大大促进PTMs蛋白质组学研究及其在生物学、临床医学中的应用,为系统生物学研究翻开新的一页。

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Recent advances in separation methods for post-translational modification proteomics

XU Jingjing1,2, LIU Xing1, ZHOU Hu1*

(1.DepartmentofAnalyticalChemistry,ShanghaiInstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201203,China;2.ChemicalDrugsDepartment,ShanghaiInstituteofFoodandDrugControl,Shanghai201203,China)

Post-translational modifications (PTMs) are the key control of many cellular processes. Current progresses of separation methods for PTMs proteomics, including reversed phase (RP) chromatography, ion exchange (IEX) chromatography, hydrophilic interaction chromatography (HILIC), porous graphitic carbon (PGC) chromatography, capillary electrophoresis (CE) and size-exclusion chromatography (SEC) are reviewed. The methods for the identification of PTMs have higher resolution and sensitivity. In addition, some other important separation methods for proteomics study are introduced, and they may be applied in the study of PTMs with further optimization in the future.

post-translational modifications (PTMs); proteomics; reversed phase (RP) chromatography; ion exchange (IEX) chromatography; hydrophilic interaction chromatography (HILIC); porous graphitic carbon (PGC) chromatography; capillary electrophoresis (CE)

10.3724/SP.J.1123.2016.08047

2016-08-31

国家自然科学基金(21375138);中国科学院“百人计划”;国家自然科学基金青年科学基金项目(31500110);江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室开放研究课题(JKLPRD201404)。.

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21375138); “One Hundred Talented People” of the Chinese Academy of Sciences; Youth Science Fund Project of National Natural Science Foundation of China (No. 31500110); Jiangsu Province Key Laboratory of Children’s Respiratory Diseases (Traditional Chinese Medicine) Open Research Topic (No. JKLPRD201404).

O658

A

1000-8713(2016)12-1199-07

邹汉法研究员纪念专辑(上)·专论与综述

* 通讯联系人.E-mail:zhouhu@simm.ac.cn.