S1P4受体通过Akt调节骨髓瘤细胞凋亡的机制研究

杨融辉,石小岩,傅 迪,仲 媛,郑金科,廖爱军



S1P4受体通过Akt调节骨髓瘤细胞凋亡的机制研究

杨融辉,石小岩,傅 迪,仲 媛,郑金科,廖爱军*

目的 探讨S1P受体对多发性骨髓瘤(MM)细胞系LP-1生存及凋亡的影响及调控机制。方法 应用芬戈莫德(FTY720)抑制LP-1细胞S1P受体，CCK-8法测定细胞生存率，流式细胞仪检测凋亡率。应用qRT-PCR方法检测LP-1细胞中S1P受体的表达情况。应用 S1P4R-shRNA敲除S1P4受体，采用荧光显微镜及qRT-PCR法测定病毒感染率及感染后S1P4受体表达。Western blot方法检测S1P4受体敲除后抗凋亡蛋白Akt、Survivin、Birc4、Bag-1表达情况。结果 FTY720处理后，LP-1细胞生存率明显下降，凋亡率明显上升，与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。LP-1细胞中S1P4受体呈高表达，敲除S1P4受体后，抗凋亡蛋白Akt、Survivin、Birc4、Bag-1表达明显下降(P<0.05)。结论 S1P受体对LP-1细胞生存具有重要作用。其中S1P4受体在LP-1细胞凋亡中起主要作用。S1P4受体可通过Akt调节下游抗凋亡蛋白Survivin、Birc4、Bag-1的表达，从而影响LP-1细胞凋亡。

S1P4受体;多发性骨髓瘤；Akt；凋亡

0 引言

多发性骨髓瘤(MM)是浆细胞异常增殖的恶性肿瘤，随着治疗药物的逐渐增多，MM疗效较前明显改善，但目前仍无法治愈[1-2]。笔者前期研究证实，1-磷酸鞘氨醇(S1P)受体抑制剂芬戈莫德(FTY720)可诱导MM细胞系U266产生凋亡及自噬[3]，而 Pi3k/Akt/mTOR通路对细胞凋亡及自噬均具有调节作用，已成为MM靶向药物研究的热点之一。本研究旨在探讨S1P受体(S1PRs)对多发性骨髓瘤LP-1细胞系生存及凋亡的影响，并探讨S1PRs对Pi3k/Akt/mTOR通路的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 LP-1细胞系(我院血液内科冻存)，慢病毒S1P4R-shRNA及LV-NC(上海吉玛公司)，RPMI 1640培养基(Thermo公司)，标准胎牛血清(Thermo公司)，DMSO(Sigma公司)，CCK-8试剂盒(Dojindo公司)，RNA提取试剂盒(全式金公司)，逆转录试剂盒(全式金公司)，PCR试剂盒(全式金公司)，PCR引物(大连宝生公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养、增殖率及凋亡率检测 实验选用人多发性骨髓瘤LP-1细胞系，细胞复苏后置入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 ℃+5% CO2环境孵箱中培养。取对数期细胞进行CCK-8检测，细胞接种于96孔板，调整细胞密度为2.5×104/mL，每孔90 μL，实验组加入FTY720，调整终浓度为10.0 μmol/L，对照组加入等量含LP-1细胞的RPMI 1640培养基，空白组加入等量不含细胞的培养基。37 ℃+5% CO2环境孵箱中培养24 h后加入CCK-8试剂10 μL，继续孵育4 h，酶标仪检测450 nm处吸光度值(OD值)，计算细胞的生存率，生存率(%)=(OD实验组-OD对照组) /(OD空白组-OD对照组)×100%。每组实验重复3次，取平均值。另取实验组及空白组细胞，调整密度1×106/mL接种，孵箱培养24 h后收集细胞，按照流式凋亡试剂盒处理细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.2 PCR检测 PCR法检测LP-1细胞系S1PRs表达水平差异。提取细胞总RNA并合成cDNA，实验步骤依据试剂盒要求进行；然后以cDNA为模板，GAPDH为内参，用S1PRs引物进行PCR扩增，引物序列见表1。

表1 引物序列

设定反应条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，63 ℃ 30 s，40个循环后记录循环阈值(Ct值)。采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。实验重复3次，取Ct平均值进行分析。

1.2.3 S1P4受体敲除 收集对数期细胞接种于6孔板，调整细胞密度为1×106/mL，实验组加入S1P4R-shRNA慢病毒 25 μL/孔+Polybrene 10 μL/孔，对照组加入等量阴性对照(LV-NC)及Polybrene，置于孵箱培养，荧光显微镜每24 h观察一次细胞GFP表达情况，结合荧光蛋白表达粗估转染效率。72 h后采用PCR法检测细胞系S1P4受体是否敲除。

1.2.4 Western blot方法 收集转染S1P4R-shRNA和LV-NC病毒及未经处理过的 LP-1细胞，提取细胞总蛋白，按2.5×106/mL的细胞密度转移至离心管，1 500 r/min离心5 min，仔细吸净上清。加入RIPA裂解液200 μL，充分裂解后，14 000 r/min离心5 min，取上清于-80 ℃冻存。BCA法测定蛋白浓度，计算蛋白上样量并上样，SDS-PAGE凝胶电泳后转移到PVDF膜上，BSA封闭2 h后，加入Survivin、Bag-1、Birc4、Akt、GAPDH单克隆抗体(1∶500)，4 ℃孵育过夜，TBST液洗膜3次，5 min/次，然后加入HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h，再次洗膜3次，5 min/次，ECL发光液显影，用image-J 软件分析灰度值。

2 结果

2.1 FTY720对LP-1细胞生存及凋亡的影响 CCK-8结果显示，FTY720处理后，细胞生存率明显降低(图1A)，凋亡率明显增高(图1B)，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图1 FTY720对LP-1细胞生存及凋亡的影响

2.2 LP-1细胞S1PRs表达情况 LP-1细胞系中S1P4受体相较于其他受体呈高表达。见图2。

图2 LP-1细胞S1PRs表达情况

2.3 S1P4受体敲除结果 荧光显微镜观察显示，无论S1P4R-shRNA还是LV-NC组，细胞内均呈高荧光状态，表明慢病毒质粒均进入细胞内(图3A)。qRT-PCR结果显示，与对照组比较，S1P4受体敲除达74%(图3B)。

2.4 S1P4R敲除后抗凋亡蛋白表达情况 Western bolt 结果显示，与正常细胞及空质粒相比，敲除S1P4受体后，细胞内Akt、Survivin、Bag-1、Birc4表达明显减低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图3 S1P4受体敲除情况

3 讨论

S1P是一种鞘脂类化合物，已被证实对肿瘤细胞生长、代谢、血管生成、死亡等进程具有重要调节作用。S1P的生物学功能是通过与其受体S1PRs相结合实现的[4]。S1PRs分为5种(S1PR1～5)，各受体亚型能偶联不同G蛋白偶联受体，调节下游信号，实现对生物学功能的调节[5]。FTY720是S1P类似物，实际上起到S1PRs抑制剂的作用，能有效抑制各S1P受体亚型活性[6]。本研究结果显示，经FTY720处理后，LP-1细胞生存率明显降低，凋亡率明显提高，表明S1PRs受体对多发性骨髓瘤LP-1细胞生长生存及凋亡具有重要作用。

Pi3k/Akt/mTOR通路是影响细胞凋亡调控的经典通路之一，其中Akt是通路中的重要蛋白，除通过下游mTOR调节Bcl-2等抗凋亡因子活性外，Akt还能通过激活下游NF-κB通路、磷酸化p53结合蛋白、抑制caspase 9的活性等，直接或间接调节Survivin、Birc4、Bag-1等凋亡相关因子，阻止凋亡级联反应的启动和进行[7-8]。在LP-1细胞系中，S1P4受体呈高表达状态，推测S1P4受体是调节LP-1细胞系生长生存的主要受体亚型。敲除S1P4受体后，Akt表达明显降低，说明S1P4受体可通过Pi3k/Akt/mTOR通路调节下游信号。

图4 S1P4受体敲除后抗凋亡蛋白表达情况

Survivin、Birc4、Bag-1均是活性较强的凋亡抑制因子，已被证实参与多发性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤发生、发展等多个进程[9-10]。其中Survivin和Birc4均能作用于caspase酶，Survivin能直接或通过caspase 9间接抑制caspase 3和caspase 7活性抑制细胞凋亡[ 11-12]，Birc4在抑制caspase 3和caspase 7活性之外，还能通过结合TNF-α受体相关因子TRAF1和TRAF2抑制细胞凋亡[13 ]。而Bag-1可与Hsp70/Hsc70、Raf-1及蛋白酶体等形成复合体，参与细胞周期调控、应激反应及蛋白修饰等，并通过Bcl-2等多种途径抑制细胞凋亡[14]。本研究中，敲除S1P4受体后，Survivin、Birc4、Bag-1表达均明显下降，推测S1P4受体可通过Akt途径调节下游抗凋亡蛋白，从而抑制细胞凋亡。

S1P4受体对多发性骨髓瘤LP-1细胞系生存及凋亡具有重要调控意义，抑制S1P4受体可下调Akt、Survivin、Birc4、Bag-1等抗凋亡蛋白水平，促进LP-1细胞凋亡，S1P4受体可能是多发性骨髓瘤治疗的潜在靶点。本实验为前期实验，对于S1P4受体如何影响多发性骨髓瘤细胞凋亡的深入研究仍需进一步进行。

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Mechanism of S1P4 receptor in regulating apoptosis of myeloma cells via Akt

YANG Rong-hui,SHI Xiao-yan,FU Di,ZHONG Yuan,ZHENG Jin-ke, LIAO Ai-jun*

(Department of Hematology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To explore the effect of S1P receptor on the survival and apoptosis of LP-1 cell line of MM and its mechanism.Methods Fingolimod (FTY720) was used to inhibit S1P receptor of LP-1 cell line;CCK-8 assay was performed to evaluate cell viability and flow cytometry was performed to detect the apoptosis rate.The expression of S1P receptors was measured by qRT-PCR.S1P4R-shRNA was used to knock down S1P4 receptor,then the expression of S1P4 was measured by fluorescence microscope and qRT-PCR assay.The expression of antiapoptotic protein Akt,Bag-1,Birc4 and Survivin in S1P4 silented cell was detected by Western blot.Results The LP-1 cell survival rate decreased significantly after FTY720 treatment,and the apoptosis rate was also significantly increased (P<0.05).S1P4 receptor expression in LP-1 cell line was the highest,while the expression of anti-apoptotic protein Akt,Bag-1,Birc4 and Survivin decreased obviously after the S1P4 receptor was knocked down (P<0.05).Conclusion S1P receptors play an important role in the survival of LP-1 cells,while S1P4 receptor plays a major role in the apoptosis of LP-1 cells.S1P4 receptor can regulate the expression of antiapoptotic protein Bag-1,Birc4 and Survivin via Akt,and affect the apoptosis of LP-1 cells

S1P4;Multiple myeloma;Akt;Apoptosi;

2016-07-28

中国医科大学附属盛京医院血液内科,沈阳 110004

国家自然科学基金 (81272629)

10.14053/j.cnki.ppcr.201611002

*通信作者