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何首乌提取物对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠的影响

2016-12-14曾雅莉

实用药物与临床 2016年11期
关键词:何首乌抵抗提取物

唐 静,曾雅莉,何 婷



何首乌提取物对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠的影响

唐 静1,曾雅莉1,何 婷2*

目的 研究何首乌不同提取物对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠血糖、胰岛素抵抗及InsR基因表达的影响。方法 高脂饲料喂养联合腹腔内注射小剂量四氧嘧啶制造糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型,分别用二甲双胍、何首乌水提物、何首乌乙醇提取物、何首乌正丁醇提取物进行干预,观察给药前后大鼠空腹血糖、血清胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛素敏感指数(ISI),采用RT-PCR法测定肝细胞膜InsR mRNA基因表达情况。结果 三组何首乌提取物的血糖、FINS、HOMA-IR水平较模型组显著下降(P<0.01),ISI水平显著上升(P<0.01);肝细胞膜上InsR基因表达量上升。结论 何首乌提取物改善2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗,可能与上调InsR基因表达量有关。

何首乌提取物;糖尿病;血糖;胰岛素抵抗;InsR

0 引言

胰岛素抵抗是影响2型糖尿病进程和发展的主要病理因素之一[1]。胰岛素受体(Insulin receptor,InsR)基因分布较广,如脂肪、肝脏、骨骼肌等。胰岛素发挥其功能必须以InsR为介导,细胞InsR数目减少,胰岛素与胰岛素受体结合能力减低[2-3],可引起血糖升高。何首乌是蓼科蓼族何首乌PolygonummultiflorumThumb.的干燥块根,具有解毒(截疟)、消痈、润肠通便的功效[4]。陈俊等[5]研究显示,制何首乌可以降低糖尿病大鼠的血糖,抑制胰岛细胞凋亡。

本实验通过高脂饲料喂养联合腹腔内注射小剂量四氧嘧啶的方法,建立大鼠的糖尿病胰岛素抵抗模型,分别用二甲双胍、何首乌水提物、何首乌乙醇提取物、何首乌正丁醇提取物进行干预,观察给药前后大鼠空腹血糖、血清胰岛素水平,计算HOMA-IR、ISI,并从InsR基因表达角度探讨何首乌提取物改善胰岛素抵抗的机制,为何首乌进一步的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 药材 何首乌生药(湖北天济中药饮片有限公司);二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司);葡萄糖(GLu)购自南京建成生物工程研究所;75%乙醇为中国医药(集团)上海化学试剂公司产品,Trizol试剂购自nvitrogen公司,cDNA第一链合成试剂盒购自Fermentas公司,Ex TaqTM、DL2000 DNA Marker购自TAKARA公司。

1.2 仪器 血糖仪one touch(强生中国),R-205型旋转蒸发仪(瑞士BuChi公司),ADVIA2400型全自动生化分析仪(德国西门子),EDC-810型PCR仪(东胜创新生物科技有限公司)。

1.3 动物 SD大鼠SPF级,雌雄各半[武汉大学动物实验中心,实验动物生产许可证号:SCXK(鄂)2014-0004],高脂饲料(配方:10%猪油、10%蔗糖、5%蛋黄粉、1%胆固醇、74%常规饲料)。

1.4 何首乌提取物的制备 取何首乌生药5 kg,洗净、阴干、切片,用蒸馏水加热回流提取3次,每次回流时间2 h,合并提取液,经减压浓缩至干,得何首乌水提物,临用前稀释至一定浓度(10 g/kg)后备用。再取5 kg药材,按文献[6]方法提取,浓缩至0.5 mL/g后,向其中加入95%乙醇至溶液中含醇量为70%,虹吸上清液,沉淀减压抽滤后得何首乌醇提物,稀释至一定浓度(10 g/kg)后备用;将上清液加入正丁醇萃取,回收,至干,稀释至一定浓度(10 g/kg)后,得何首乌正丁醇提取物,备用。

1.5 大鼠糖尿病模型的建立及分组 取健康SD大鼠,适应性喂养3 d,除正常组外,其余组高脂喂养,4周后,于腹腔注射现配四氧嘧啶溶液,于30 s内注射完,连续注射2 d[7](第1天剂量为120 mg/kg,第2天剂量为100 mg/kg),末次注射后第3天测定血糖情况(随机血糖≥11.1 mmol/L作为糖尿病模型成功的标志[8])。造模成功后,将大鼠随机分为模型组、阳性对照组、何首乌水提组、何首乌醇提组、何首乌正丁醇组。除正常组饲以基础饲料外,其余组给予高脂饲料喂养,正常组与模型组给予等体积的生理盐水,连续灌胃喂养6周。于末次给药后禁食12 h,用10%水合氯醛麻醉大鼠后,取血测定FPG、FINS,计算ISI、HOMA-IR。ISI=IN[1/(FPG×FINS)],HOMA-IR=(FRG×FINS)/22.5],处死后,留取肝脏组织进行相关研究。

1.6 RT-PCR检测mRNA Trizol法提取RNA后,逆转录成cDNA,设计Real-time PCR引物(表1),采用RT-PCR法,检测各组大鼠肝脏内InsR的表达。应用2-ΔΔCt方法对InsR mRNA的表达水平进行定量分析,即处理组基因表达水平相对于正常组的变化倍数为2-ΔΔCt倍[9],最终数据以2-ΔΔCt进行分析(表1)。

表1 PCR引物序列表

2 结果

2.1 何首乌提取物对大鼠血糖的影响 给药0周时,与正常组相比,其余各组大鼠血糖、胰岛素水平增加明显,表明其已发生糖尿病胰岛素抵抗。给药6周后,与模型组相比,阳性对照组和何首乌提取物各组血糖均出现下降,且差异均有统计学差异(P<0.01);三组何首乌提取物之间的降糖疗效比较,差异无统计学意义(P>0.05)。这说明三组何首乌提取物疗效相近,均可在一定程度上降低糖尿病大鼠血糖水平。见表2、表3。

2.2 何首乌提取物对大鼠FINS、HOMA-IR、ISI的影响 连续给药6周后,阳性对照组、三组何首乌提取物组2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠FINS、HOMA-IR水平较模型组显著下降(P<0.01)、ISI水平显著上升(P<0.01);且何首乌醇提物组与阳性对照组在控制FINS、HOMA-IR、ISI水平上比较差异无统计学意义(P>0.05),说明其改善胰岛素抵抗的疗效与二甲双胍相当,而水提、正丁醇提取物在改善胰岛素抵抗方面与二甲双胍有一定的差异。见表3、表4。

表2 何首乌提取物对血糖的影响(mmol/L)

注:与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01

表3 何首乌提取物对胰岛素的影响(mIU/L)

注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01;与阳性对照组比较,△P<0.05

2.3 何首乌提取物对InsR基因表达的影响 不同组别扩增出来的内参β-actin表达一致,说明整个实验体系正常(图1)。在给药6周后,与正常组相比,模型组InsR基因表达出现明显下调(P<0.05),阳性对照组及何首乌各给药组与模型组相比均能使大鼠的InsR mRNA表达出现显著上调,但差异无统计学意义(图2、图3)。

表4 何首乌提取物对HOMA-IR、ISI的影响

注:与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01;与阳性对照组比较,△P<0.05

图1 RT-PCR β-actin表达图

注:1.DL2000,2.正常组,3.模型组,4.阳性对照组,5.何首乌水提组,6.何首乌醇提组,7.何首乌正丁醇组

图2 RT-PCR InsR表达图

注:1.DL2000,2.正常组,3.模型组,4.阳性对照组,5.何首乌水提组,6.何首乌醇提组,7.何首乌正丁醇组

图3 何首乌提取物对大鼠肝细胞膜InsR mRNA相对表达的影响

注:与正常组比较,*P<0.05

3 讨论

我国2013年糖尿病的患病人数为9 840万,居全球首位,预计到2035年我国的糖尿病患病人数将达到1.43亿。胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的主要原因之一[10]。在正常机体组织中,细胞膜上的胰岛素受体与胰岛素结合非常敏感。由于肥胖等原因造成细胞膜上的胰岛素受体功能下降或者数量减少,使胰岛素不能与受体正常结合,导致胰岛素不能发挥应有的作用,就会发生胰岛素抵抗[11]。

本研究以高脂高糖饲料喂养大鼠引起大鼠高脂血症、高胰岛素血症。采用四氧嘧啶腹腔注射造模,因一次性大剂量腹腔注射造模方法成活率较低[7],改为两次给药造模。造模后,模型组大鼠FPG、FINS、HOMA-IR升高,ISI降低,说明2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型造模成功。

李奇等[12]采用水提法、醇提法等7种方法制备的何首乌提取物均含有二苯乙烯苷类、没食子酸类、芦荟大黄素类、大黄酸类、大黄素类化合物,只是含量不同。本实验通过3种不同提取工艺,证实何首乌提取物均能有效降低糖尿病大鼠的血糖水平,且能改善胰岛素抵抗。

InsR是一种跨膜的大分子糖蛋白[13],是胰岛素信号转导的起始部位,其表达水平直接影响胰岛素的生物学效应[14]。本研究发现,在糖尿病胰岛素抵抗的大鼠模型中,血糖升高,InsR基因表达水平明显降低(P<0.05),在给予何首乌提取物治疗后,血糖水平逐渐下降,InsR基因表达量上调,且三组何首乌提取物在增强InsR基因表达量上差异无统计学意义(P>0.05)。陈绍文等[15]发现,采用何首乌生品大鼠灌胃后,何首乌中有相当数量成分在大鼠体内快速代谢或者反应。结合本实验的研究结果,提示何首乌中可能存在某类成分或代谢产物,能改善胰岛素抵抗,且有效成分在三组提取物中均存在,可能只是含量存在差异,且以何首乌醇提物组内成分含最较高,这类物质或代谢产物均能通过上调靶组织内InsR基因表达水平,改善该组织对胰岛素的敏感程度,降低血糖。

综上所述,我们初步认为,何首乌提取物通过上调糖尿病大鼠肝脏组织InsR基因表达水平,促进葡萄糖的摄取与利用,降低血糖,提示何首乌提取物在改善胰岛素抵抗方面可能会有一定的疗效。但其改善胰岛素抵抗的机制仍需进一步探讨。

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Effect of polygonum multiflorum extract on insulin-resistant rats with type 2 diabetes

TANG Jing1,ZENG Ya-li1,HE Ting2*

(1.Liyuan Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430077,China;2.The No.3 Hospital of Wuhan,Wuhan 430060,China)

Objective To study the effects of different extracts from polygonum multiflorum on glucose,insulin-resistance and InsR gene expression in rats with insulin-resistant diabetes.Methods The diabetic rats were induced by intraperitoneal injection of a small dose of alloxan and were fed with high-fat diet.The rats were divided into different groups and were given metformin,water extract,ethanol extract,n-butyl alcohol extract from polygonum multiflorum.The glucose and fasting insulin (FINS) was measured before and after administration,and the homeostasis model assessment-insulin resistance (HOMA-IR) index and insulin sensitive index(ISI) were calculated.The expression levels of insulin receptor (InsR) mRNA were detected by PCR.Results Compared with control group,three different extracts from polygonum multiflorum reduced the glucose,FINS and HOMA-IR (P<0.01),elevated the ISI (P<0.01),and increased the expression of InsR.Conclusion Three different extracts from polygonum multiflorum obviously improve the insulin resistance by increasing the expression of InsR mRNA.

Polygonum multiflorum extract;Diabetes;Blood glucose;Insulin resistance;InsR

2016-05-19

1.华中科技大学同济医学院附属梨园医院,武汉 430077;2.武汉市第三医院药剂科,武汉 430060

华中科技大学自主创新基金(2014QN072)

10.14053/j.cnki.ppcr.201611004

*通信作者

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