白色金针菇摇瓶发酵培养基的优化研究

张怡，王玉*，班立桐，黄亮，郑志广，肖月梅

（天津农学院农学与资源环境学院，天津300384）

白色金针菇摇瓶发酵培养基的优化研究

张怡，王玉*，班立桐，黄亮，郑志广，肖月梅

（天津农学院农学与资源环境学院，天津300384）

以菌丝球干质量、密度、直径为考察指标，利用单因素试验和L9(34)正交试验对白色金针菇摇瓶发酵培养基进行优化。结果表明，最适摇瓶培养基配方为：葡萄糖10 g/L、红糖13 g/L、黄豆粉3 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、VB10.01 g/L。在此条件下，白色金针菇菌丝球干质量达到15.48 g/L，菌丝球密度66.48个/mL，菌丝球直径为1.45 mm。

白色金针菇；摇瓶发酵；培养基优化

白色金针菇（Flammulina velutipes）是一种低温型、经济价值很高的优质食用菌，其菇体乳白鲜嫩，菌柄绒毛少，口感较好，富含蛋白质、氨基酸、维生素、矿物元素等多种营养物质[1-2]。我国白色金针菇的生产大多利用空调、通风设备等在厂房中进行工厂化全年生产，传统的食用菌菌种扩繁为母种、原种、栽培种三级固体菌种扩繁方式，存在生长周期长、菌龄不一致、成本高、管理过程繁杂等缺点[3]，而液体菌种具有生长周期短、出菇整齐、工艺简便、易规模生产、成本低廉、效率高等优势[4-5]。

本试验通过单因素试验及正交试验确定白色金针菇摇瓶发酵培养基的最佳配方，为白色金针菇液体发酵工厂化生产过程的控制提供相关的技术参数。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

白色金针菇（Flammulina velutipes）T-011：天津滨海德盛农业科技有限公司。

1.1.2 培养基

斜面培养基[6]：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L。

种子、液体发酵培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，VB10.01 g/L。

1.1.3 化学试剂

葡萄糖：秦皇岛鹏远淀粉有限公司；琼脂、蛋白胨、牛肉浸粉、酵母膏：北京奥博星生物技术有限公司；磷酸二氢钾：天津市光复科技发展有限公司；硫酸镁：天津市化学试剂三厂；氢氧化钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙醇（体积分数为95%）：天津市风船化学试剂科技有限公司；乳糖：天津市奥淇医科医药销售有限公司；麦芽糖：新兴化工试剂研究所；红糖：北塘区博零食尚食品商行；尿素：天津市北方天医化学试剂厂；麦麸：市售；黄豆粉：北大荒集团；玉米浆：上海方畦仪器有限公司。所有化学试剂均为分析纯或生化试剂。

1.2 仪器与设备

BSP-250恒温培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SBA-40E生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所；GIX-GF101-1-S-Ⅱ电热恒温鼓风干燥箱：上海贺德实验设备有限公司；ZHWY-2102恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3实验方法

1.3.1 菌种活化[7-8]

将白色金针菇菌种块（1.5～2.0 cm2）接种到斜面培养基上，25℃条件下培养至满管，挑取菌丝粗壮、浓密、无污染的菌种4℃条件下冷藏备用。

1.3.2 白色金针菇液体菌种生长曲线的测定

将0.5 cm24块活化的白色金针菇菌块置于装液量为100mL/250mL液体发酵基中，25℃静置24h，25℃、120r/min继续培养至200 h，定时取样，分别测量液体菌种的菌丝球干质量、密度、直径等指标，确定白色金针菇生长状态。

1.3.3 种子液的制备

将0.5cm24～5块活化的白色金针菇菌块接种于装液量为100mL/250mL种子培养基中，25℃静置培养24h，25℃、120 r/min继续培养72 h。

1.3.4 白色金针菇摇瓶液体菌种的制备

装液量为100 mL/250 mL，接种量10%，25℃静置24 h，25℃、120 r/min继续培养120 h。

1.3.5 白色金针菇液体发酵最适碳源的筛选

分别考察添加量为20 g/L的葡萄糖、红糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖，摇床（25℃、120 r/min）培养7 d后，检测菌丝球干质量、密度和直径，确定最适碳源。

1.3.6 白色金针菇液体发酵最适氮源的筛选

分别考察添加量为5 g/L蛋白胨、牛肉浸粉、尿素、麦麸、酵母膏、黄豆粉、玉米浆，摇床（25℃、120 r/min）培养7 d后，检测菌丝球干质量、密度和直径，确定最适氮源。

1.3.7 白色金针菇液体发酵培养基优化正交试验[9]

在单因素试验基础上，利用L9（34）正交设计，以菌丝球干质量为评价指标，对葡萄糖（A）、红糖（B）、黄豆粉（C）含量进一步优化，正交试验因素与水平见表1。

表1 培养基配方优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium formula optimization

1.3.8 指标检测方法[10]

（1）菌丝球干质量测定方法

取一定体积发酵培养液，80目筛网过滤得到菌丝球，蒸馏水洗涤2次，于80℃烘干至恒质量。

（2）菌丝球密度检测方法

1 mL发酵培养液中菌丝球的数目即为菌丝球密度。

（3）菌丝球直径检测方法

取1 mL培养液置于皿中，随机取至少10个菌丝球，将其紧密相连排成一线，用直尺测量其总长度，并计算菌丝球平均直径。

2 结果与分析

2.1 白色金针菇液体菌种生长曲线的测定

将种子液接种于发酵培养基静置24 h后，每24 h取样，检测菌丝球干质量、密度和直径，结果见图1。

图1 白色金针菇生长曲线Fig.1 Growth curve ofF.velutipes

由图1可知，随着培养时间的增加，白色金针菇液体菌种菌丝球干质量也逐渐增大；72 h后菌体进入快速生长阶段，192h时菌丝球干质量达到最大值；192 h后，菌丝球逐渐变为棉絮状，培养液黏度很大，导致溶氧不足，且由于养分减少，菌丝逐渐自溶，干质量下降。菌丝球直径随着培养时间延长先增大后减小，菌丝球密度变化趋势与直径相反，菌球直径变小而密度增加。液体菌种接种于栽培瓶后，菌丝球密度越大则生长点越多，且前期预实验结果表明，直径偏小的菌丝球在栽培料中萌发较快。本试验与马瑞霞等[11-12]的结果一致。结果表明，为保证菌丝球生长良好，确定液体发酵摇瓶培养时培养120 h为宜。

2.2 白色金针菇液体发酵最适碳源的筛选

考察不同碳源（添加量均为20 g/L）对白色金针菇液体发酵生长的影响，结果见图2。

图2 不同碳源对白色金针菇生长的影响Fig.2 Effects of different carbon sources onF.velutipes growth

由图2可知，当碳源为红糖时，菌丝球干质量最大，菌丝球的密度和直径仅次于碳源为葡萄糖的情况；当碳源为葡萄糖时，菌丝球的密度最大，直径最小，而干质量仅次于红糖。本实验与PANAGIOTA D等[13]的研究结果一致。由于红糖价格较高，因此选择红糖和葡萄糖各10 g/L作为培养基碳源。

2.3 白色金针菇液体菌种最适氮源的筛选

考察不同氮源（添加量均为5 g/L）对白色金针菇液体发酵生长的影响，结果见图3。

图3 不同氮源对白色金针菇生长的影响Fig.3 Effects of different nitrogen sources onF.velutipesgrowth

由图3可知，以尿素为氮源时，培养基中仅有少量菌丝，无菌丝球产生，其余氮源均有菌丝球产生，可见无机氮源不利于白色金针菇的生长。菌丝球干质量较高的氮源种类依次为黄豆粉、蛋白胨和麦麸，其中黄豆粉为氮源的菌丝球中混有少量未降解的黄豆粉原料。黄豆粉的菌丝球密度也最大，且明显高于麦麸和蛋白胨，并且菌丝球直径也最小。朱家骝等[14]的实验表明最适氮源为麸皮或麸皮水。本研究认为由于麦麸（麸皮）在使用前需先煮沸取上清液，工序复杂不利于工业化生产。因此，选择黄豆粉为最适氮源。

2.4 白色金针菇液体菌种最适培养基的正交试验

由于无机盐与维生素对金针菇菌丝生长影响较小[15]，所以本研究以菌丝干质量为评价指标，利用L9（33）正交设计对白色金针菇液体菌种培养基的主要成分进行了优化，正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。

由表2可知，通过极差比较，各因素对白色金针菇液体发酵菌丝产量的影响由小到大顺序为：红糖＞黄豆粉＞葡萄糖。培养基配方最优组合为A2B3C2，即最适摇瓶培养基的配方为：葡萄糖10 g/L、红糖13 g/L、黄豆粉5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、VB10.01 g/L。在此最佳培养基配方条件下进行验证试验，白色金针菇液体发酵菌丝干质量可达到15.48g/L，菌丝球密度66.48个/mL，菌丝球直径1.45mm。由表3可知，葡萄糖、红糖和黄豆粉对白色金针菇液体发酵菌丝产量均有显著影响（P＜0.05），其中红糖含量有极显著影响（P＜0.01）。

表2 培养基配方优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由于表2中没有最优组合为A2B3C2，因此进行验证实验，结果表明，在最适培养基配方中，白色金针菇液体发酵菌丝干质量可达到15.48g/L，菌丝球密度66.48个/mL，菌丝球直径1.45mm。优化后的白色金针菇液体菌种菌丝球干质量大、密度大、直径小、且大小均一，较之初始配方干质量和密度分别提高了90.88%、89.50%，各项指标明显提高。

3 结论

通过对白色金针菇液体菌种生长曲线的测定，确定发酵养时间为静置24 h后，培养72 h。利用单因素试验确定最适碳源、氮源分别为葡萄糖、红糖，黄豆粉。通过正交试验确定二级摇瓶培养基配方为葡萄糖10 g/L、红糖13 g/L、黄豆粉5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、VB10.01 g/L。优化后的白色金针菇液体菌种菌丝球干质量大、密度大、直径小、且大小均一，较未优化培养基干质量和密度分别提高了90.88%、89.50%。

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Optimization of shaking flask fermentation medium ofFlammulina velutipes

ZHANG Yi,WANG Yu*,BAN Litong,HUANG Liang,ZHEN Zhiguang,XIAO Yuemei
(College of Agronomy&Resources and Environment,Tianjin Agricultural University,Tianjin,300384,China)

Using the dry mass,density and diameter of mycelia as the evaluation indexes,the shaking flask medium ofFlammulina velutipeswas optimized by single factor experiments and L9(34)orthogonal experiments.The results showed that the optimum shaking flask medium formula were glucose 10 g/L,brown sugar 13 g/L,soybean meal 3 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO40.5 g/L,VB10.01 g/L.Under the conditions,the dry mass,density and diameter of mycelia were 15.48 g/L,66.48 unit/mL and 1.45 mm,respectively.

Flammulina velutipes;shake flask fermentation;medium optimization

S646.1

0254-5071（2016）11-0136-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.028

2016-06-26

天津市农业科技成果转化与推广项目（201303010）；东丽区科技型中小企业发展专项资金产学研合作项目（2014001）

张怡（1985-），女，实验师，硕士，主要从事食用菌方面的研究工作。

*通讯作者：王玉（1980-），女，副教授，硕士，主要从事食用菌方面的研究工作。