响应面法优化合萌总黄酮提取工艺

朱媛媛，赵 明, 2*，欧阳臻，蔡建明，张 成，周文菊，刘江弟，杨 倩，王琳玮

(1. 江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013；2. 江苏大学附属医院，江苏 镇江 212013)



响应面法优化合萌总黄酮提取工艺

朱媛媛1，赵 明1, 2*，欧阳臻1，蔡建明1，张 成1，周文菊1，刘江弟1，杨 倩1，王琳玮1

(1. 江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013；2. 江苏大学附属医院，江苏 镇江 212013)

目的：利用响应面法优化合萌中总黄酮的提取工艺条件。方法：通过单因素试验分别考察提取时间、乙醇体积分数、液固比、提取温度及提取次数对合萌总黄酮得率的影响，并选取提取时间、乙醇体积分数、液固比、提取温度为影响因子，应用响应面法优化提取工艺。结果：合萌总黄酮的最佳提取条件为：提取时间60 min，乙醇浓度65%，液固比(g∶mL)25∶1，提取温度90 ℃，在此条件下，合萌总黄酮得率为4.08 mg/g，接近模型预测值4.11 mg/g。结论：响应面法在一定程度上可以提高合萌总黄酮得率，表明响应面法用于合萌总黄酮提取工艺的优化具有可行性。

合萌；总黄酮；响应面法

合萌为豆科蝶形花亚科合萌属植物合萌(AeschynomeneindicaL.)的干燥全草，又名田皂角，俗称水槐。味甘、苦，性微寒，归肺、胃经。全草入药，具有清热利湿，祛风明目，通乳等功效。能治水肿腹胀、肿毒、湿疹、胆囊炎、尿道感染或结石、肾炎水肿等[1]。分析研究表明，黄酮类化合物具有抗菌、抗氧化自由基活性、保肝作用、抗骨质疏松作用、抗肿瘤等多种药理作用[2-6]，但合萌中黄酮类化合物的研究尚未有文献报道。本实验首先采用单因素试验分析提取时间、乙醇体积分数、液固比、提取温度及提取次数对合萌总黄酮得率的影响，并选取提取时间、乙醇体积分数、液固比、提取温度4个因素为影响因子，采用Box-Behnken设计建立数学模型，以合萌总黄酮得率为响应值，采用Design Expert 软件进行数值分析，得出最优提取工艺条件，为合萌总黄酮的进一步开发和研究提供参考。

1 实验仪器和材料

1.1 仪器与设备

SHB-111循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；HHS-1恒温水浴锅，上海浦东跃新科学仪器厂；AE240分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限司；1810-B型自动双重纯水蒸馏器，上海申立玻璃仪器公司；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海恒科学仪器有限公司；UV-2102PCS型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)分析仪器有限公司；旋转蒸发仪，瑞士BUCHI公司；H66 MC超声清洗机，无锡超声仪器厂。

1.2 药品与试剂

合萌(采收于江苏省丹阳市导墅镇，经欧阳臻教授鉴定为合萌AeschynomeneindicaL.)；芦丁对照品，中国食品药品检定研究院，批号：100080-200707；三氯化铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、乙醇等试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水为实验室自制。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的芦丁对照品15.2 mg，置25 mL容量瓶中，加70%乙醇使之溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备

干燥的合萌全草经粉碎，过20目筛，备用。精密称取合萌干燥粉末2.0 g，置于100 mL圆底烧瓶中，按照一定的提取温度、提取时间、乙醇体积分数、液固比、提取次数进行回流提取，趁热抽滤，合并提取液，将滤液浓缩后，转移至50 mL的容量瓶，定容，摇匀，作为供试品溶液，备用。

2.2 标准曲线的绘制

精密量取芦丁对照品溶液6份(0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL)，分别加入25 mL容量瓶中，加70%乙醇至6 mL，加入5% 亚硝酸钠1 mL，摇匀，放置6 min，再加10% 硝酸铝1 mL，摇匀，放置6 min，再加1 mol/L 氢氧化钠10 mL，70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min，于510 nm波长下测吸光度。以对照品溶液浓度为横坐标x，吸光度测定值为纵坐标y，绘制标准曲线，如图1所示。用最小二乘法计算得到回归方程为y=0.0129x-0.0373，r=0.9996。在12.16～60.80 μg/mL范围内芦丁对照品浓度与吸光度呈良好的线性关系。

图1 芦丁标准曲线

2.3 合萌总黄酮含量测定

精密量取供试品溶液5.0 mL，根据亚硝酸钠-硝酸铝法，即“2.2”项下的方法测定吸光度，计算合萌总黄酮含量，按以下公式计算合萌总黄酮得率。

式中：P 为合萌总黄酮的得率(mg/g)，C为从回归方程计算求得样品溶液的浓度(μg/mL)，V1为样品溶液定容体积(mL)，V2为提取液定容体积(mL)，V3为取样溶液体积(mL)，M为合萌粉末质量(g)。

2.4 单因素试验设计

2.4.1 提取温度对合萌总黄酮得率的影响

以合萌总黄酮得率为指标，在固定提取时间60min，乙醇体积分数70%，液固比20∶1，提取次数2次的条件下，考察不同提取温度(60、70、80、90、100 ℃)对合萌总黄酮得率的影响。总黄酮得率随提取温度变化结果如图2所示。

结果表明，当温度低于80 ℃时， 随温度的上升，总黄酮得率变化不大，当温度高于80℃时，随温度的上升总黄酮得率显著升高，并在90 ℃时达到最高值，但当温度高于90 ℃时，总黄酮得率反而下降，这可能是由于温度过高导致可溶性蛋白变性，影响细胞的破裂，导致总黄酮溶出减少，从而降低了合萌总黄酮得率[7]。因而确定最佳提取温度为90 ℃。

图2 提取温度对合萌总黄酮得率的影响

2.4.2 提取时间对合萌总黄酮得率的影响

以合萌总黄酮得率为指标，在固定提取温度90 ℃，乙醇体积分数70%，液固比20∶1，提取次数2次的条件下，考察不同提取时间(30、45、60、75、90min)对合萌总黄酮得率的影响。总黄酮得率随提取时间变化结果如图3所示。

结果表明：随时间增加，合萌总黄酮提取率先上升后下降，60min时达到最高点，提取时间过长或过短时，合萌总黄酮得率均较低。这可能是由于提取时间过短时，合萌总黄酮提取不充分，而时间过长时，合萌总黄酮受热时间过长，其中主要成分部分发生分解。因而确定最佳提取时间为60min。

图3 提取时间对合萌总黄酮得率的影响

2.4.3 乙醇体积分数对合萌总黄酮得率的影响

以合萌总黄酮得率为指标，在固定提取温度90 ℃，提取时间60min，液固比20∶1，提取次数2次的条件下，考察不同的乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)对合萌总黄酮得率的影响。总黄酮得率随乙醇体积分数变化结果如图4所示。

结果表明：当乙醇体积分数较小时，合萌总黄酮得率随乙醇体积分数的增加而上升，且当乙醇体积分数为70%时达到最高；当乙醇体积分数大于70%时，合萌总黄酮得率随乙醇体积分数的增加反而下降，且下降幅度很大。造成这种现象可能是由于乙醇体积分数过大时，醇溶性杂质或色素等成分溶出增加，从而使合萌总黄酮得率下降。因而确定最佳乙醇体积分数为70%。

图 4 乙醇体积分数对合萌总黄酮得率的影响

2.4.4 液固比对合萌总黄酮得率的影响

以合萌总黄酮得率为指标，在固定提取温度90 ℃，提取时间60min，乙醇体积分数70%，提取次数2次的条件下，考察不同液固比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)对合萌总黄酮得率的影响。总黄酮得率随液固比变化结果如图5所示。

结果表明，合萌总黄酮得率随液固比的增加而增加，但当液固比大于25时，总黄酮得率趋于稳定。在实际操作中，既要考虑总黄酮得率，又要避免溶剂浪费，因而确定最佳液固比为25∶1。

图 5 液固比对合萌总黄酮得率的影响

2.4.5 提取次数对合萌总黄酮得率的影响

以合萌总黄酮得率为指标，在固定提取温度90 ℃，提取时间60min，乙醇体积分数70%，液固比25:1的条件下，考察不同的提取次数(1、2、3、4次)对合萌总黄酮得率的影响。总黄酮得率随提取次数变化结果如图6所示。

结果表明：合萌总黄酮得率随提取次数增加而增加，但增幅逐渐减小。从图中可以看出提取3次后，曲线基本趋于稳定，即总黄酮得率趋于稳定，因而视作提取4次后已提取完全。经计算得知提取一次后转移率为73.98%，提取2次后转移率达到91.02%，这表明提取两次后，合萌中总黄酮已基本转移完全。因而确定最佳提取次数为 2 次。

图 6 提取次数对合萌总黄酮得率的影响

2.5 响应面试验设计优化合萌总黄酮提取工艺

2.5.1 响应面试验设计因素水平

依据单因素试验结果确定因素水平范围，利用Design-ExpertSoftware8.0.6为辅助手段设计响应面试验。根据中心组合设计原理，以提取温度、提取时间、乙醇体积分数、液固比4个因素为自变量，合萌总黄酮的得率为响应值，设计了4因素3水平共29个试验点的响应面分析试验，其中24个为析因试验，5个为中心试验，其因素水平分析选取见表1。

表1 响应面因素水平编码

2.5.2 模型方程的建立与方差分析

按照“2.5.1”项下进行响应面分析试验，方法与结果见表2，方差分析结果见表3。采用Design-

Expert( 8.0.6 版本) 软件对实验结果进行分析，以总黄酮得率为响应值，对实验数据进行二元多项式回归拟合，得出回归方程为：

Y=3.96+0.12A+0.066B-0.50C+0.058D-0.027AB-0.077AC-0.070AD+0.030BC+0.040BD-0.075CD-0.65A2-0.21B2-0.53C2-0.20D2

式中：Y为总黄酮得率，A为提取温度，B为提取时间，C为乙醇体积分数，D为液固比。

表2 响应面分析试验结果

表3 方差分析结果

注：***P<0.001为极显著，**P<0.01为高度显著，*P<0.05为显著。

由表3方差分析结果可知，回归模型是极显著的(P<0.001)，同时该模型的相关系数r=0.990 1，CV值为2.17%。说明该模型能够反映响应值的变化，而且方程的失拟项(P=0.134 0)不显著，表明该方程对实验拟合情况好、误差小，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析和预测。

2.5.3 响应曲面的分析

根据回归方程，作出响应面和等高线，考察拟合响应面的形状，分析提取温度、提取时间、乙醇体积分数、液固比对合萌总黄酮提取得率的影响。各因素及其相互作用对相应值的影响可以通过各图直观反应出来。Design-ExpertSoftware8.0.6软件处理后三维响应面和等高线图见图7～12。

根据图7～12及表3可知，一次项中，乙醇体积分数(C)、提取温度(A)对总黄酮得率的线性效率极显著(P<0.001)，提取时间(B)对总黄酮得率的线性效率高度显著(P<0.01)，液固比(D)对总黄酮得率的线性效率显著(P<0.05)，二次项中，A2、B2、C2和D2影响均极显著(P<0.001)，交互项按影响大小排列依次为AC、CD、AD、BD、BC、AB，其中提取温度和乙醇体积分数交互项即AC对合萌总黄酮的提取率有显著影响，其他交互项均不显著，表明各因素对黄酮得率不是简单的线性关系。同时，由F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，4个因素对总黄酮提取得率影响的排序为乙醇体积分数(C)>提取温度(A)>提取时间(B)>液固比(D)。

2.6 验证实验

由Design-Expert8.0.6软件分析得出合萌总黄酮的最优提取工艺为：提取温度91.06 ℃，提取时间62.02min，乙醇体积分数65.05%，液固比26.16∶1，其总黄酮得率为4.11mg/g。根据实际情况可将条件优化为提取温度90 ℃，提取时间60min，乙醇体积分数65%，液固比25∶1。在此优化条件下，进行3次平行实验进行验证，结果表明合萌平均总黄酮得率为4.08mg/g，与模型预测值的误差为0.73% ，说明该方程与实际情况拟合较好。

3 结论与讨论

响应面分析克服了正交设计在考虑因素间交互作用时，如果任意安排正交表中各列因素将会导致交互效应与其它效应混杂的缺陷。响应面分析法是研究几种因素间交互作用的回归分析方法[8]。本实验采用单因素试验和响应面分析法对合萌总黄酮的提取工艺进行优化，并结合实际情况得出最优条件：提取温度90 ℃，提取时间60min，乙醇体积分数65%，液固比25∶1，在此优化条件下，总黄酮得率为4.08mg/g。回归分析和验证试验结果表明，模型拟合情况好、实验误差小，可用于实际预测，从而也说明了采用响应面分析法中Box-Behnken对合萌总黄酮提取条件进行优化合理可行，具有一定的实际应用价值。

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Optimization of Extraction for Flavonoids fromAeschynomeneindicaL.by Response Surface Methodology

Zhu Yuanyuan1，Zhao Ming1, 2*，Ouyang Zhen1，Cai Jianming1，Zhang Cheng1,Zhou Wenju1，Liu Jiangdi1，Yang Qian1，Wang Linwei1

(1. School of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China;2. Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Objective: Response Surface Methodology (RSM) was used to optimize the extraction technology of total flavonoids fromAeschynomeneindicaL.. Methods: In single-factor tests, extraction time, ethanol concentration, liquid-solid ratio, extraction temperature and extraction times on yield of total flavonoids were explored. Among them, extraction time, ethanol concentration, liquid-solid ratio and extraction temperature were selected as influencing factors during extraction. The extraction technology was optimized by RSM. Results: The optimal extraction conditions of total flavonoids were extraction time of 60 min, ethanol concentration of 65%, liquid-solid ratio (g∶mL) of 25∶1, extraction temperature of 90 ℃. Under the optimal conditions, the yield of total flavonoids was 4.08 mg/g, which was close to the predicted value (4.11 mg/g). Conclusion: RSM can improve the yield of total flavonoids in a certain extent, which indicated that RSM is feasible to optimizing the extraction technology of total flavonoids fromAeschynomeneindicaL..

AeschynomeneindicaL.; flavonoids; Response Surface Methodology (RSM)

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.05.003

2016-03-28

江苏省中医药局科技项目(LB 13037)；江苏省江苏大学第13批大学生科研立项资助项目(13A167)。

朱媛媛(1992—)，女, 在读硕士研究生，主要从事中药活性成分研究及新药开发。E-mail：1462936884@qq.com

*通讯作者： 赵明(1962—)，男，主任中药师，硕士研究生导师，主要从事中药活性成分研究及新药开发工作。 E-mail：anchorage8@126.com

R284.2

A

1006-9690(2016)-05-0009-05