低磷食物对模拟失重小鼠后肢骨骨质丢失防治作用的探讨

郭慧慧 张璐 申晋斌 冯娟 栗向东 张蓉

·实验研究论著·

低磷食物对模拟失重小鼠后肢骨骨质丢失防治作用的探讨

郭慧慧 张璐 申晋斌 冯娟 栗向东 张蓉

目的初步探讨低磷食物对模拟失重下小鼠骨丢失防治的可能性及防治效果，为后期可能的临床应用提供实验依据。方法利用尾部悬吊法模拟失重。将24只C57BL/6雌性小鼠随机分为四组，即对照（CON）组、对照低磷（CON⁃LP）组、悬尾（SUS）组及悬尾低磷（SUS⁃LP）组，每组6只。4周实验期满后取小鼠后肢骨标本，通过Micro⁃CT扫描分析比较各组小鼠股骨的骨体积分数（bone volume frac⁃tion,BV/TV）、骨小梁密度（trabecular density,Tb.Density）等骨密度参数，骨小梁厚度（trabecular thickness, Tb.Th）、平均骨小梁数（trabecular number,Tb.N）等骨形态学参数。通过抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate⁃resistant acid phosphatase,TRAP）染色、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和丽春红三色（Ponceau S）染色对各组小鼠胫骨生长发育和改建情况进行组织形态学观察。结果Micro⁃CT结果显示，CON⁃LP组与CON组比较：骨密度参数BV/TV和Tb.Density减小（P＜0.05），形态学参数Tb.Th增高和Tb.N减少（P＜0.05）。SUS⁃LP组与SUS组比较：骨密度参数BV/TV和Tb.Density减小（P＜0.05），形态学参数Tb.Th和Tb.N减少（P＜0.05）。染色结果显示：悬尾的小鼠（SUS组、SUS⁃LP组）与地面的小鼠（CON组、CON⁃LP组）比较，骨小梁出现明显的骨吸收，Tb.N减少、骨小梁间距变大。CON⁃LP组与CON组比较，Tb.Density减低、Tb.N减少。SUS⁃LP组与SUS组比较，骨小梁变细、Tb.N减少。结论低磷食物对模拟失重下小鼠后肢骨骨丢失防治效果不明显，甚至可能产生不利的后果。

模拟失重；低磷食物；股骨；胫骨；骨质丢失

在执行太空任务中，航天员由于受到微重力、强辐射、超低温、高真空、弱磁场、噪声和昼夜节律变化等不良环境因素的影响，而引发其机体骨骼肌肉系统、心血管系统、免疫系统和神经-内分泌系统等各个系统的改变［1⁃4］。在所发生的一系列改变中，大部分系统变化具有一定自限性，会达到新的平衡状态不再继续发展，但骨骼系统的变化由于没有自限性，会出现持续性骨密度下降、骨质丢失［5⁃7］，呈现进行性的过程［8，9］。随着航天工程的迅猛发展，航天员在太空环境停留时间将越来越长，骨矿盐的持续丢失对机体的危害严重，也将成为妨碍人类长期太空停留和探索外星球的主要障碍之一。目前科学家和学者已经进行了大量的研究工作，但仍未明确骨丢失的机制。运动锻炼、药物预防和营养补充等各种防护措施均无法有效地防止失重环境下负重骨的骨丢失。较长时间（＞1个月）的太空飞行可使骨丢失可达15％，而返回地球1年后仅能恢复6％［10，11］。因此，预防失重下骨丢失的研究已成为相关领域研究的重点和热点。

悬尾鼠是用于研究模拟失重下身体机能改变、废用性骨质疏松症病因及治疗的成熟动物模型［12］。本课题组在前期实验研究过程中发现悬吊4周后，小鼠的血磷水平升高明显，同时在高磷食物饲养鼠的配对研究中发现：悬尾和高磷食物饲养均可减少胫骨骨形成、增加吸收。从而推测血磷的升高可能是导致失重后后肢骨丢失的重要原因。由此，我们提出假设：是否可以通过低磷饮食防治模拟失重小鼠后肢骨骨丢失？

本研究于2015年10月至2016年8月通过对模拟失重小鼠进行低磷食物干预，观察低磷饮食对小鼠骨组织形态学改变的影响，初步探讨低磷食物对模拟失重下骨丢失防治的可能性及防治效果，为后期可能的临床应用提供实验依据。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

戊巴比妥钠（西安舟鼎国生物技术有限责任公司），4％多聚甲醛（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），乙二胺四乙酸钠（MPBiomedicals公司，美国），高效切片石蜡（上海华灵康复器械厂），抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶染色试剂盒（南京建成科技有限公司），二甲苯、无水酒精、甲苯胺蓝、苏木素和伊红（上海国药集团化学试剂有限公司），甲基绿（Sigma公司，美国），冰醋酸（重庆川东化工公司）中性树脂（上海标本模型厂），1％磷钨酸（上海谱振生物科技有限公司），丽春红染色试剂（上海里奇生物科技有限公司）。

DST641型实验动物称量用电子秤（苏州苏杭科技器材有限公司），载玻片和盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司），TS⁃12U生物组织自动脱水机、BM⁃IX生物组织包埋机、冷冻台和CS⁃Ⅵ型摊片烤片机（孝感宏业医用仪器有限公司），GZX⁃GFC电热恒温鼓风干燥机（上海博泰实验设备有限公司），LEICA RM2235石蜡切片机（Leica公司，德国），BX⁃43型正置显微镜成像系统（Olympus公司，日本），Micro⁃CT（Siemens公司，德国）。

二、动物模型的建立和实验分组

选取第四军医大学实验动物中心提供的C57BL/6清洁级雌性小鼠24只，体重平均为（17.0± 1.0）g。小鼠先在动物实验室适应性饲养7 d，保证足量的清洁饮水和鼠粮。动物饲养房温度为24℃，相对湿度为50％，光照/黑暗时间均为12 h。本实验研究通过了第四军医大学口腔医院实验动物管理伦理委员会批准（伦理批准号：2015伦审字061号）。

将24只雌性小鼠随机分为四组，每组6只。饲养食物均由第四军医大学实验动物中心饲料科配制。对照（CON）组为地面状态正常食物饲养，对照低磷（CON⁃LP）组为地面状态低磷食物饲养，悬尾（SUS）组为悬尾状态正常食物饲养，悬尾低磷（SUS⁃LP）组为悬尾状态低磷食物饲养。正常食物含磷0.7％，含钙0.9％；低磷食物含磷0.35％，含钙0.9％。小鼠尾吊参照陈杰等［13］改进的方法操作，小鼠始终保持30°头低位及后肢伸直不能触笼底，前肢可自由活动。

三、标本的获取及制备

4周实验期满，各组小鼠称重后腹腔注射1％戊巴比妥钠注射液50mg/kg。麻醉药起效后，分离右侧后肢骨，置于4％多聚甲醛液固定24 h。股骨标本进行Micro⁃CT扫描测量；胫骨标本用10％乙二胺四乙酸液脱钙后石蜡包埋，切片机经冠状面切5μm厚连续切片，60℃烘干后，4℃保存，用抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate⁃resistantacid phosphatase,TRAP）染色、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和丽春红三色（Ponceau S）染色。

四、Micro⁃CT扫描及重建分析

采用Inveon Micro⁃CT对小鼠股骨进行扫描及三维重建。将股骨平行于水平面放入样品管中进行扫描。扫描参数：分辨率为10μm，电压为80 kV，电流为450μA，扫描方式为360°旋转，扫描时间为40min，平均帧数为1帧，角度增益为0.5°，曝光时间为400ms。感兴趣区域（region of interest,ROI）为股骨远端生长板上0.5～1.5mm区域的骨小梁（图1 a），对其进行三维图像重建。使用Micro⁃CT系统自带的Inveon ResearchWorkplace 2.2软件进行骨小梁形态定量分析，获得骨体积分数（bone volume fraction, BV/TV）、骨小梁密度（trabecular density,Tb.Density）等骨密度参数，骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb. Th）、平均骨小梁数（trabecular number,Tb.N）等骨形态学参数。

五、组织形态学分析

（一）TRAP染色

采用TRAP染色试剂盒，操作方法参照说明书进行。胫骨标本石蜡切片常规二甲苯脱蜡及梯度酒精水化。按说明书配制底物反应液。切片用固定液固定标本少许时间后清水漂洗，将混合后的底物反应液滴加切片上，显微镜下观察切片染色呈金黄色；苏木精复染5min；甲基绿复染5min。最后梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察。

（二）ALP染色

采用碱性磷酸酶染色试剂盒（钙钴法），操作方法参照说明书进行。胫骨标本石蜡切片常规二甲苯脱蜡及梯度酒精水化，切片用固定液固定标本，再在标本上滴加基质液。37℃避光孵育15min，甩掉多余染液，立即滴加显色液A，染色5min，水洗30 s；再滴加显色液B，染色5min，水洗30 s；滴加复染剂，复染30 s，甩干。最后酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察。

（三）Ponceau S染色

胫骨标本石蜡切片常规二甲苯脱蜡及梯度酒精水化后，1％磷钨酸浸泡10min，去离子水冲洗后浸入甲苯胺蓝10min，70％酒精分化1min，苦味酸-桔黄G混合液30 s，2％丽春红2R-丽春红结晶混合3min，以上每一操作之后都需用去离子水冲洗，中性树胶封片，显微镜下观察。

六、统计学分析

采用SPSS 13.0（SPSS公司，美国）统计软件进行统计学分析。所得计量数据均以均数±标准差（±s）表示，两独立样本组间比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析（One⁃way ANOVA），方差齐性计量资料采用LSD多重检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结果

一、股骨标本Micro⁃CT结果

Micro⁃CT三维重建可见：正常小鼠（CON组）的股骨远端ROI处骨小梁结构完整，厚度分布均匀（图1 a）。悬尾的小鼠（SUS组、SUS⁃LP组）与地面的小鼠（CON组、CON⁃LP组）比较，Tb.N明显减少，骨小梁间距增大，骨小梁变细、厚薄不均，其立体网状结构受到破坏，连续性中断（图1 b～d）。

进一步对骨小梁的扫描结果进行定量分析后发现，CON⁃LP组与CON组比较，骨密度参数BV/TV减小（P=0.006）、Tb.Density减小（P=0.001）；形态学参数Tb.Th增高（P=0.122）、Tb.N减少（P=0.000）。SUS⁃LP组与SUS组比较，骨小梁结构散乱，骨密度参数BV/TV减小（P=0.000）、Tb.Density减小（P=0.002）；形态学参数Tb.Th（P=0.024）、Tb.N减少（P=0.002）（表1）。

表1　四组小鼠股骨远端骨小梁感兴趣区域Micro⁃CT参数统计表（±s，n=6）

表1　四组小鼠股骨远端骨小梁感兴趣区域Micro⁃CT参数统计表（±s，n=6）

注：与CON组比较，*P＜0.05；与SUS组比较，#P＜0.05

组别CON组CON⁃LP组SUS组SUS⁃LP组BT/TV（％）4.88±0.86 4.73±0.82*1.54±0.75 1.27±0.05#Tb.Th（μm）0.025±0.008 0.028±0.006 0.022±0.001 0.020±0.004#Tb.N（mm-1）1.89±0.22 1.65±0.49*0.85±0.30 0.59±0.21#Tb.Density 1 433.82±13.32 1 393.56±18.69*1 254.90±11.01#1 241.52±17.16

二、胫骨切片染色形态学观察结果

小鼠胫骨干骺端的骺生长板自上而下为贮备区（Ⅰ区）、增生区（Ⅱ区）、肥大区（Ⅲ区）、钙化区（Ⅳ区）和成骨区（Ⅴ区）（图2）。

（一）TRAP染色情况

软骨细胞出现死亡消失，留下空洞状的软骨陷窝，陷窝内可见TRAP染色阳性的破骨细胞，表现为深红色，细胞形态较大（图2 a）。

（二）ALP染色情况

活跃的ALP染色阳性的成骨细胞，表现为褐色，细胞形态呈小圆形（图2 b）。

（三）Ponceau S染色情况

在钙化的骨小梁表面沉淀骨基质，形成由骨和钙化的软骨组成的混合性的骨小梁（图2 c）。

图1　小鼠股骨Micro⁃CT扫描图及感兴趣区域骨小梁三维结构重建图（bar=1 mm）CON组（a）股骨远端ROI骨小梁结构完整，厚度分布均匀；SUS组（c）、SUS⁃LP组（d）与CON组（a）、CON⁃LP组（b）比较，Tb.N明显减少，骨小梁间距增大，骨小梁变细、厚薄不均，其立体网状结构受到破坏，连续性中断

图2　小鼠胫骨干骺端的骺生长板染色后显微镜下组织形态学观察（×400，bar=100μm）a～c：Ⅰ区为贮备区，Ⅱ区为增生区，Ⅲ区为肥大区，Ⅳ区为钙化区，Ⅴ区为成骨区；悬尾组（SUS组、SUS⁃LP组）和地面组（CON组、CON⁃LP组）比较，可见骨小梁出现明显的骨吸收，Tb.N减少，骨小梁间距变大；CON⁃LP组与CON组比较，Tb.Density减低、骨小梁变粗、Tb.N减少。SUS⁃LP组与SUS组比较，Tb.Density升高、骨小梁变细、Tb.N减少，在破骨细胞邻近的骨小梁可见明显的骨质缺损

四组小鼠胫骨组织切片（成骨区）在光学显微镜下观察差别明显。染色结果显示，悬尾组（SUS组、SUS⁃LP组）与地面组（CON组、CON⁃LP组）比较，骨小梁出现明显的骨吸收，Tb.N减少，骨小梁间距变大。CON⁃LP组与CON组比较，Tb.Density减低、骨小梁变粗、Tb.N减少。SUS⁃LP组与SUS组比较，Tb. Density降低、骨小梁变细、Tb.N减少，在破骨细胞邻近的骨小梁有明显的骨质缺损，表现为骨质被吸收。

讨论

一、松质骨在失重性骨丢失研究中的意义

骨组织是一种适应性结构，其主要功能是满足机体的生物力学需求和矿盐代谢需要［14］，骨的负荷增加骨量与骨强度，失负荷则减少骨量与骨强度。骨强度和稳定性除受骨量影响外，还受骨结构因素影响，如骨小梁的形态、数量及骨小梁间的连接等。对于松质骨来说骨小梁的强度、稳定性与其微构筑的方式有关，骨小梁的立体网状空间结构有利于吸收震荡而不易骨折［15］。Cervinka等［16］研究发现，失重状态下骨质的丢失以松质骨为主。故本实验以小鼠后肢骨松质骨为主要研究对象，探讨低磷食物对预防模拟失重下骨质丢失的防治效果。

骨密度是诊断骨质疏松的重要参数，可反映约70％的骨强度情况，且其测量方法统一、结果准确可靠［17］。本研究中骨密度参数包括BV/TV和Tb.Den⁃sity CT值，松质骨密度变化范围为0.1～1.0 g/cm3，数据跨度是1个数量级，所以即使骨密度只发生微小的变化，也将会对松质骨力学性能产生巨大影响。由于松质骨的密度和BV/TV主要反映骨密度的变化，而骨形态学参数可以提供有关骨实际结构的信息，有助于提高骨强度预测的准确性，Micro⁃CT是一种分辨率高达微米级的三维定量分析仪，能够从骨小梁结构水平上评价骨的结构和功能［18，19］。本研究中形态学参数包括Tb.Th和Tb.N，Micro⁃CT结果显示悬尾小鼠（SUS组、SUS⁃LP组）与地面小鼠（CON组、CON⁃LP组）比较，股骨远端和胫骨干骺端Tb.N明显减少、间距变大，表明模拟失重下后肢骨松质骨丢失明显。与孙平等［20］报道一致，证实尾部悬吊法导致了小鼠后肢骨骨丢失，建模成功。

二、控制血磷水平在改善骨丢失中的可行性

磷作为人体第二大丰富的矿物质，对于维持机体内环境的稳定和多种细胞生理活动非常重要［21］。机体内85％的磷以羟基磷灰石结晶的形式存在于骨组织［22］。磷在骨矿物质中的作用之一是维持机械强度，另外以无机磷的形式存在于骨中维持细胞内磷的稳定保证生命过程的完成。近年来，磷感受器通过感受血液和细胞周围磷离子浓度的变化并传递给效应细胞，由此产生的一系列生物学效应研究引起了学者们对磷的代谢及生物学功能越来越广泛的重视和关注［23，24］。体外研究已证实，高磷/低磷对软骨细胞［25］、成骨细胞［26］、破骨细胞［27，28］活性都有影响，从而影响骨矿化及骨重建。

失重环境下，骨骼细胞感受力学刺激，转化为生物学反应，骨吸收活性增加同时骨基质矿化减少，骨基质溶解释放钙磷入血，同时骨细胞周围磷浓度增高，处于高磷环境。体内钙磷代谢的平衡及其在细胞内外液中浓度的稳定对维持正常骨代谢有重要作用［29］。Calvo等［30］已有研究证实，高血磷可引起骨的吸收增加、减少骨基质矿化。在失重环境下航天员骨丢失没有自限性的原因之一可能是产生了“失重→骨丢失→磷释放入血→高血磷→骨损害”的恶性循环。故通过控制血磷水平，从而改善骨丢失情况为一个理论上可行的方法。

三、本研究低磷干预结果分析与存在的不足

本实验中，通过分析骨小梁微观结构和应力分布的关系，探索低磷食物干预是否能改善模拟失重悬尾鼠后肢骨骨丢失情况。股骨Micro⁃CT结果显示，低磷食物干预后骨小梁结构散乱，Tb.N较少，间隙增大；骨密度参数BV/TV和Tb.Density均减小（均P＜0.05），形态学参数Tb.N降低（P＜0.05），提示低磷干预后小鼠松质骨骨形成与骨吸收的最终结果是不利的。Micro⁃CT有其不可代替的优势，但仍不能完全代替组织形态学与生物代谢指标检测［31］。为进一步验证Micro⁃CT的结果，对胫骨标本进行TRAP、ALP、Ponceau S染色，得到了相似的结果。ALP、TRAP染色分别从成骨细胞、破骨细胞水平间接反映骨形成与骨吸收，较好地体现了骨重建与骨转换。染色结果显示，低磷食物饲养后小鼠胫骨破骨细胞增多，成骨细胞减少，骨小梁变细，Tb.N减少，Tb.Density减低，呈现骨量减少的趋势，提示低磷干预后骨改建结果为新骨形成减少，旧骨吸收增加。Micro⁃CT结果和染色结果表明给予低磷食物干预后，小鼠后肢骨骨微结构发生明显改变，骨吸收大于骨形成，提示低磷食物饲养的小鼠后肢骨骨丢失情况更为严重，不仅没有起到治疗模拟失重下小鼠后肢骨骨丢失的作用，甚至可能产生不利的后果。

低磷饮食作为一种治疗方法在临床上已有应用，一般推荐为慢性肾脏疾病（CKD）Ⅱ期的透析患者开始限磷饮食治疗，然而限磷饮食伴随着蛋白质摄入量的减少，可能导致营养不良［32］。目前临床指南多推荐慢性肾衰竭患者建议低磷饮食，一般限制在500～600mg/d，并辅以α-酮酸治疗。但观察时间均较短，长期低磷饮食对骨组织形态学的影响在国内外研究均鲜见报道。分析本实验研究结果原因可能为低磷喂食时间长（28 d），且没有辅助治疗导致蛋白摄入不足而引起营养不良所致。

本研究为初步探讨性研究，实验样本数量较少，其结论还有待进一步验证。在下一步研究设计中应参照CKD患者限磷食谱，既精确把握低磷食物中磷的含量又同时保证鼠粮中蛋白质含量，从而减少可能出现的骨强度下降等副作用，为后期可能的临床应用提供实验依据。

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Preventive and therapeutic effect to hind limb bone loss of m ice under conditions of simu lated weightlessness w ith low phosphate diet:a pilot study.

GUO Huihui*,ZHANG Lu,SHEN Jinbin,FENG Juan,LIXiangdong,ZHANGRong.*State Key Laboratory ofMilitary Stomatology＆amp;National Clinical Research CenterforOral Diseases＆amp;Shaanxi Key Laboratory ofStomatology,Department ofOperative Density and Endo⁃dotics,SchoolofStomatology,the Fourth MilitaryMedicalUniversity,Xi'an 710032,China
Corresponding author:ZHANGRong,E⁃mail：zhangrong@fmmu.edu.cn

Objective To investigatewhether low phosphate(Pi)diethas a preventive and therapeutic effecton bone loss ofmice hindlimb under simulated weightlessness.M ethods Twenty female C57BL/6mice were divided into 4 groups randomly:the control group(CON),the controlmicewith low Pidiet(CON⁃LP),the tail suspension group(SUS),and the tail suspension group with low Pidiet(SUS⁃LP).After 4⁃week experiments, allmicewere sacrificed and the righthindlimbswere removed as the specimens.The bone volume fraction(BV/ TV),trabecular bone thickness(Tb.Th),trabecular bone number(Tb.N)and average density CT value(Tb. Density)in 4 groups were compared by micro⁃CT scanning,reconstruction and analysis.Meanwhile,TRAP, ALP and Ponceau S stains were used for the proximal tibia slices to observe the histomorphologic changes. Results Micro⁃CT showed that Tb.Th in CON⁃LP group was higher than that in CON group(P＜0.05).As compared with the SUS group,BV/TV,Tb.Density,Tb.Th and Tb.N in SUS⁃LP group were significantly decreased(P＜0.05).TRAP,ALP and Ponceau S staining showed a significant difference among the 4 groups. As compared with the CON/CON⁃LP group,the trabecular bone losswas significant in the SUS/SUS⁃LP group. And thenumberof trabecularbonewas lessand the trabecularbone separation distancewas larger than in CON/CON⁃LP group.As compared with the CON group,the trabecular bone density and the number of trabecular bone were reduced in the CON⁃LP group.As compared with the SUS group,the trabecular bone width was thinner and the trabecular bone numberwas less in the SUS⁃LP group.Conclusion The results indicate that the preventive and therapeutic effect to hind limb bone loss ofmice under conditions of simulated weightless⁃nesswith low phosphate dietwasnot feasible,and itmighteven be harm ful to do so.

Simulated weightlessness;Low⁃Pidiet;Femur;Tibia;Bone loss

10.3969/j.issn.1674⁃8573.2016.06.012

国家自然科学基金项目（31170898）；回国人员启动基金（HG3101）

710032西安，军事口腔医学国家重点实验室口腔疾病国家临床医学研究中心陕西省口腔医学重点实验室第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科（郭慧慧、申晋斌、冯娟、张蓉）；陕西省西安市临潼疗养院第二疗养区口腔科（张璐）；第四军医大学西京医院骨科（栗向东）

张蓉，E⁃mail：zhangrong@fmmu.edu.cn

郭慧慧和张璐对本文有同等贡献，并列第一作者

（2016⁃06⁃06）