神经降压素受体1在大鼠肺缺血再灌注损伤中的表达及作用*

周志毅，朱幸沨，孙洁，陈静瑜，杨国仪

（江苏省无锡市人民医院1.病理科；2.胸外科，江苏 无锡 214023；3.江苏省人体器官移植重点实验室，江苏 无锡 214023）

论著

神经降压素受体1在大鼠肺缺血再灌注损伤中的表达及作用*

周志毅1，朱幸沨2，孙洁3，陈静瑜2，杨国仪1

（江苏省无锡市人民医院1.病理科；2.胸外科，江苏 无锡 214023；3.江苏省人体器官移植重点实验室，江苏 无锡 214023）

目的观察神经降压素受体1（NTR1）在大鼠肺缺血再灌注损伤LIRI模型中的表达和作用及其与Toll样受体4（TLR4）和缺氧诱导因子（HIF-1α）的关系，探讨NTR1在LIRI中的病理作用机制。方法40只雄性SD大鼠，分为8组进行观察。①假手术组；②LIRI组；③LIRI+生理盐水对照组；④LIRI+DMSO对照组；⑤LIRI+脂多糖干预组（TLR4激活组）；⑥LIRI+TAK-242干预组（TLR4抑制组）；⑦LIRI+NT干预组（NTR1激活组）；⑧LIRI+SR48692干预组（NTR1抑制组）。制作大鼠原位LIRI模型，取各组大鼠左肺组织，观察肺组织病理变化、行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及蛋白质印迹法检测，统计分析NTR1在大鼠LIRI模型中的表达及作用及其与TLR4和HIF-1α的关系。结果肺IRI组NTR1 mRNA及蛋白的表达较假手术组增加（P＜0.05）；NT可进一步增加LIRI的炎症因子水平、细胞凋亡及肺组织病理损伤，而SR48692可减轻上述改变（P＜0.05）；与LIRI组比较，脂多糖干预组NTR1表达进一步增强，而TAK-242干预组NTR1表达则受到抑制（P＜0.05）；与LIRI组比较，HIF-1α mRNA和蛋白表达被SR48692抑制，而被NT增强（P＜0.05）。结论 NT-NTR1与LIRI关系密切，参与了LIRI的发病机制，在LIRI中，可能存在TLR4-NTR1-HIF-1α信号通路，本研究为发现新的LIRI有效治疗靶点提供了理论依据。

大鼠；肺；缺血再灌注损伤；NTR1；TLR4

肺移植是终末期肺疾病患者的唯一治疗方案，但约20%肺移植会发生肺缺血再灌注损伤（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI），LIRI是原发性移植肺功能衰竭的最主要原因，后者的死亡率高达60%[1]。炎症性损伤是LIRI的重要相关因素，与LIRI的成因密切相关。目前，神经降压素（neurotensin，NT）及神经降压素受体1（neurotensin receptor 1，NTR1）已被证实与炎症病理过程有密切关系。炎症因子Toll样受体4（TLR4）特异性激动剂LPS刺激可促进NTR1介导的炎症作用，如上调IL-8表达[2]。说明NTR1可能参与了缺血再灌注损伤病理过程，NTR1是否参与LIRI及TLR4介导的炎症病理过程还不明确。另有研究表明，NT-NTR1可通过活化缺氧诱导因子（HIF-1α）调控大肠炎的炎症过程[3]。本实验通过建立大鼠LIRI及干预模型，观察NTR1在LIRI中的表达、NTR1对LIRI的作用及NTR1与TLR4和HIF-1α的关系，从而探讨NTR1在LIRI中的病理作用机制及可能存在的信号通路，为寻找新型治疗手段提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级雄性SD大鼠，体重250～300 g，40只，购于扬州大学比较医学中心。采用随机数字表法将SD大鼠分为8组，每组5只：①假手术组；②LIRI组；③LIRI+生理盐水对照组，静脉注射生理盐水2 ml；④LIRI+DMSO对照组，静脉注射2 ml DMSO；⑤LIRI+脂多糖干预组，将1.5 mg的TLR4特异性激活剂脂多糖溶于2 ml生理盐水中，静脉注射；⑥LIRI+TAK-242干预组，将TLR4特异性抑制剂TAK-242 10 mg/kg溶于2 ml DMSO，静脉注射；⑦LIRI+NT干预组，将4 nmol/kg的NT溶于2 ml生理盐水，静脉注射；⑧LIRI+SR48692干预组，将2 mg/kg的SR48692溶于2 ml DMSO，腹腔注射。各组均在阻断肺门前30 min进行上述相应的处理。

1.2 大鼠LIRI模型的建立

参照FARVIAI等[4]的制作方法建立原位大鼠LIRI模型，阻断大鼠左肺门1 h，再灌注3 h。具体为：经大鼠腹腔注射15 g/L的戊巴比妥钠溶液60 mg/kg进行麻醉，并腹腔注射0.5 mg/ml阿托品0.1 mg，皮下注射肝素1 000 IU/kg。大鼠经口气管插管，置入14G静脉留置针套管（长度45 mm），接动物呼吸机维持呼吸，通气频率为70～75次/min，潮气量为10 ml/kg，呼气末正压为2 cmH2O（0.196 kPa），吸入氧浓度为21%。动物保持右侧卧位，沿左侧第5肋间作3 cm切口，切开胸廓，暴露左肺门，游离下肺韧带。于吸气时完全阻断左肺门，1 h后恢复血流灌注，实验过程中腹腔注射生理盐水0.5 ml/h，于恢复血流后3 h时完整切取左肺。假手术组不阻断肺门，其他操作同LIRI组。

1.3 检测项目

1.3.1 各组肺组织中NTR1、HIF-1α、白细胞介素6（IL-6）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）等mRNA表达的检测采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）进行检测，引物序列详见表1。用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA。用HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，实验操作按产品说明书进行，然后以cDNA为模板，利用各基因的检测引物进行PCR。扩增程序为：95℃10 min，然后以95℃15 s、60℃60 s、为1个循环，进行40个循环。用ABI7900HT型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

表1 相关基因的引物序列

1.3.2 各组肺组织中相关蛋白的表达采用蛋白质印迹法进行定量检测。取-80℃冻存各组大鼠肺组

织各100 mg，加入2～3 ml的组织蛋白裂解液，匀浆器将组织研碎，取出匀浆液4℃离心（16 000 r/min）15 min。取上清液，按BCA法测定蛋白浓度。等量蛋白上样进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，用PVDF膜转膜(湿转法)。一抗包括NTR1（1∶500，美国abcam公司）及HIF-1α（1∶300，美国abcam公司），并在同样情况下测定内参β肌动蛋白（β-actin），将同一条件下待测蛋白与β-actin的吸光度值进行统计。

1.3.3 各组肺组织病理学检查取大鼠左肺中部1/3肺组织，加入4%多聚甲醛固定，行HE染色，显微镜下观察肺泡和间质水肿、中性粒细胞浸润以及出血情况，肺损伤严重性评分参考相关文献[5]。

1.3.4 各组肺组织细胞的凋亡采用原位末端标记法（TUNEL）进行检测。采用TUNEL技术标记肺组织石蜡切片中凋亡细胞核DNA3’OH，替代TUNEL反应液作阴性对照，方法参照试剂盒说明书，显微镜下观察凋亡细胞核为棕褐色，正常细胞核呈淡蓝色。每张玻片随机选取6个视野（×400倍），观察凋亡细胞，并计算凋亡指数（凋亡细胞数/整个视野细胞数×100%）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示。各组间的数据用单因素方差分析One-way ANOVA进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 假手术组及LIRI组中NTR1 mRNA及蛋白的表达

两组肺组织中NTR1 mRNA及蛋白的表达情况详见图1。LIRI组NTR1 mRNA及蛋白的表达较假手术组增加，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

2.2 各组肺组织中炎症因子、细胞凋亡、肺损伤及肺组织病理改变情况的比较

为了进一步探讨NTR1表达在LIRI中的作用，应用NT及特异性NTR1抑制剂SR48692，发现NT可进一步增加炎症因子水平（TNF-α和IL-6，图2）、细胞凋亡（图3）及肺组织病理损伤，而SR48692可减轻LIRI模型的上述改变；LIRI组肺组织呈现明显的弥漫性肺泡损伤，包括炎症、肺间隔水肿、肺泡内出血、肺不张及充血，NT可增强上述肺损伤，肺损伤严重性评分增加，而SR48692则起减轻作用（表2、图4）。

图1 两组大鼠肺组织中NTR1蛋白及mRNA的表达

图2 各组肺组织中IL-6、TNF-α mRNA表达的比较

2.3 各组肺组织中TLR4对NTR1表达的影响

经蛋白质免疫印迹检测发现，与LIRI组比较，脂多糖干预组NTR1表达进一步增强，TAK-242干预组NTR1表达则受到抑制（P＜0.05）（图5）。

与LIRI组比较，HIF-1α mRNA和蛋白表达被SR48692抑制，而被NT增强（P＜0.05，图6）。

图3 各组肺组织中细胞凋亡情况（TUNEL×200）

图4 各组肺组织的病理改变情况（HE×200）

图5 在LIRI模型中，TLR4调控NTR1蛋白及mRNA的表达

图6 在LIRI模型中，NTR1调控HIF-1α蛋白及mRNA的表达

表2 各组凋亡指数及肺缺血再灌注（IRI）损伤严重性评分的比较（±s）

表2 各组凋亡指数及肺缺血再灌注（IRI）损伤严重性评分的比较（±s）

注：与LIRI组比较，1）F=71.46，P=0.000；2）F=60.48，P=0.000；3）F=48.05，P=0.000；4）F=22.17，P=0.000

组别凋亡指数肺损伤严重性评分假手术组0.60±0.402.40±0.24 LIRI组22.60±1.699.60±0.40 LIRI+DMSO对照组23.00±1.649.00±0.71 LIRI+NT干预组30.40±1.891）12.80±0.732）LIRI+SR48692干预组12.80±1.883）7.00±1.104）

3 讨论

在组织缺血基础上恢复血流后炎症反应介质增多，导致组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤。因此，炎症性损伤是缺血再灌注损伤的重要相关因素，与其成因密切相关。在本研究中，LIRI的NTR1表达显著上调，NT-NTR1在LIRI中促进了炎症反应，发挥了损伤性病理作用，而炎症相关因子TLR4显著正调控NTR1表达，说明NT-NTR1参与并调节LIRI的病理过程，并且受TLR4的调控，可能是TLR4的下游信号，而NTR1信号可正调控HIF-1α表达，因此，本研究显示，在LIRI的发生发展中可能存在TLR4-NTR1-HIF-1α的信号通路。

NT参与炎症病理过程的早期证据是由LAZARUS等[6]发现的，他们发现NT可通过高亲和力受体与肥大细胞紧密结合，通过钙动员及磷脂酶C激活释放组胺，NTR1特异性抑制剂SR48692可阻止这一过程，表明该受体可直接激活肥大细胞，参与炎症过程。研究表明，NT-NTR1参与了多种炎症病理过程[2，7]：NT可作用于中性粒细胞、T淋巴细胞及巨噬细胞，促进炎症细胞的增殖，并具有趋化作用，增强人血中性粒细胞的吞噬作用。配体结合研究表明，NT可通过外周血淋巴细胞表面的高亲和力NT受体正调控淋巴细胞系MOLT-4的生长。在梭菌毒素A介导假膜性结肠炎模型中，梭菌毒素A注入结肠绊后，在发生分泌性及炎症性病变前，结肠黏膜的NT/NTR1 mRNA及蛋白表达短期内即明显增多，SR48692可抑制降低肠渗透性，减轻中性粒细胞浸润、肠损伤及肥大细胞活性，并具有剂量依赖性。在炎症肠病中，肠黏膜毛细血管内皮细胞表达的NTR1及NT结合可导致炎症相关细胞因子的活化。NT可增强支气管活化巨噬细胞IL-1β的表达，可刺激中性粒细胞黏附支气管上皮细胞，调节气道的炎症反应。NT可显著增加腹腔淋巴细胞的黏附性和化学趋向性，作用于硫胶质诱导的鼠腹膜巨噬细胞及骨髓来源巨噬细胞，可刺激两者的吞噬活性。以上说明NT-NTR1与炎症有着密切关系，在炎症中发挥了重要的作用，也可能是LIRI发生发展的重要作用机制。在本研究中，LIRI组的NTR1 mRNA及蛋白表达较假手术组均增强，说明NTR1与LIRI具有密切相关性，为了进一步研究NTR1在LIRI中的作用机制，研究人员应用NTR1的激动剂NT及特异性抑制剂SR48692对LIRI组进行干预，发现NT可进一步增加LIRI的炎症及病理损伤（包括炎症因子、细胞凋亡及肺组织病理损伤），而SR48692可减轻LIRI模型的上述改变，进一步表明NTR1在LIRI的发生发展中起了重要作用。

至于NT-NTR1参与LIRI发生发展的分子信号机制目前还不清楚。在本组LIRI中，TLR4信号可正调控NTR1的表达，而NTR1可正调控HIF-1α的表达。PEREIRA等[8]研究发现，在稳定的内环境中，施加LPS炎症刺激，可上调成纤维细胞系的NT/NTR1表达，促进NT信号介导的炎症过程，如上调IL-8表达，IL-8是一种强有力的中性粒细胞趋化因子。并有研究表明，NT-NTR1可通过活化HIF-1α调控大肠炎的炎症及血管形成过程[3]。HIF-1α信号通路在能量代谢、炎症反应及细胞增生与凋亡中起非常重要的作用，抑制HIF-1α的活性被认为是治疗许多疾病的新靶点，这些疾病包括局部缺血、脂多糖介导的败血症、恶性肿瘤和慢性炎症等[9-10]。在缺血性损伤或IRI预处理模型中，HIF-1α通常被认为是一种适应性因子，对器官起保护性作用[11]，事实是，HIF-1α的作用是保护性还是损害性可能依赖于损伤的类型及性质[12]。PEYSSONNAUX等[13]发现在早期脓毒症中，脂多糖诱导的TLR4依赖性HIF-1α可引发炎症细胞活素类的产生，抑制HIF-1α可减轻上述过程及脓毒症的死亡率。有关研究已报道了HIF-1α在LIRI之TLR4信号中的损害性作用[14]。据上所述，在LIRI中，可能存在TLR4-NTR1-HIF-1α信号通路，或是LIRI发生发展的分子机制之一，NTR1是其中重要的信号传递因子。NT–NTR1在炎症中还可能存在其他信号通路。ZHAO[15-17]等发现，在NCM460肠上皮细胞中，NT–NTR1的作用依赖RhoA-NF-κB信号，NT使IkBα磷酸化降解，并促进NF-κB亚基

P65的磷酸化及转录，经由细胞内钙动员及PKCα活性，促进IL-8转导活性。老鼠空肠缺血再灌注损伤的NF-kB/IκB系统激活也与NT相关。以上表明炎症中还存在NT-NTR1-NF-κB信号通路。

总之，本研究表明，NT-NTR1与LIRI关系密切，参与了LIRI的发病机制。在LIRI中，可能存在TLR4-NTR1-HIF-1α信号通路，从而为发现新的LIRI有效治疗靶点提供了理论依据。近来，有文献表明[18]，NT-NTR1除了具有促急性炎症的作用外，还可促进慢性黏膜炎症的愈合。在炎症及炎症修复中起双重作用。在急性炎症中，NT通过NF-κB信号起促炎症作用，而在慢性炎症中，NT-NTR1可通过金属蛋白酶-EGFR信号促进炎症的修复。因此，需要以后在LIRI中做进一步的研究。

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（张蕾 编辑）

Effect of NTR1 expression in rats with lung ischemia-reperfusion injury and mechanism*

Zhi-yi Zhou1,Xing-feng Zhu2,Jie Sun3,Jing-yu Chen2,Guo-yi Yang1
(1.Department of Pathology,Wuxi People's Hospital,Wuxi,Jiangsu 214023,China;2.Department of Thoracic Surgery,Wuxi People's Hospital,Wuxi,Jiangsu 214023,China;3.Jiangsu Key Larboratory of Human Organ Transplantation,Wuxi,Jiangsu 214023,China)

Objective To investigate neurotensin receptor 1(NTR1)expression and the effect and mechanism of NTR1 expression in rats with lung ischemia-reperfusion injury(LIRI).Methods Forty SD rats were randomly grouped as Sham group,LIRI group,LIRI+saline control group,LIRI+DMSO control group,LIRI+TLR4-activated group, LIRI+TAK-242 group(TLR4-inhibited group),LIRI+NTR1-activated group and LIRI+NTR1-inhibited group.The NTR1 expression and the role of NTR1 in the LIRI rats were detected with RT-PCR and Western blot and statistically analyzed.Results NTR1 mRNA and protein expressions in the LIRI group were significantly increased comparing with the sham group(P＜0.05).NT further increased the levels of inflammatory cytokines,apoptosis and lung pathological injury in the LIRI group,while SR48692 significantly reduced the above changes(P＜0.05). Compared with the LIRI group,NTR1 expression was further enhanced in the LIRI+LPS group and was significantly inhibited in the LIRI+TAK-242 group(P＜0.05).HIF-1α mRNA and protein expressions were significantly inhibited

rats；lung；ischemia-reperfusion injury；NTR1；TLR4

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.22.002

1005-8982（2016）22-0007-06

2016-04-06

无锡市医院管理中心重大扶持项目（No：YGZF1110）；江苏省人体器官移植重点实验室开放课题（No：YK201303）

杨国仪，E-mail：yanggywin2013@163.com

by SR48692 and was significantly enhanced by NT compared with the LIRI group(P＜0.05).Conclusions There is a close relationship between NTR1 and LIRI.NT-NTR1 is involved in the pathogenesis of LIRI.There may be TLR4-NTR1-HIF-1α signal pathway in LIRI and the theoretical basis is provided to find new effective therapeutic targets in LIRI.