氨氯地平对肺纤维化大鼠的影响研究*

陈菊屏，罗秀芳，刘茗心，范贤明，王文军，湛晓勤

（西南医科大学附属医院呼吸内科，四川 泸州 646000）

论著

氨氯地平对肺纤维化大鼠的影响研究*

陈菊屏，罗秀芳，刘茗心，范贤明，王文军，湛晓勤

（西南医科大学附属医院呼吸内科，四川 泸州 646000）

目的研究氨氯地平对大鼠肺纤维化的保护作用和可能的分子机制，为肺纤维化的治疗寻找新的途径。方法选取240只实验大鼠进行研究，随机分为空白组、模型组、吡非尼酮组和氨氯地平组，每组各60只。模型组、吡非尼酮组和氨氯地平组采用气管内灌注博来霉素建立肺纤维化大鼠模型，空白组则气管内灌注等量生理盐水；然后空白组和模型组大鼠给予相同量生理盐水处理，氨氯地平组大鼠则给予1/2量的氨氯地平和1/2量的生理盐水处理；吡非尼酮组给予1/2量的吡非尼酮和1/2量的生理盐水处理。采用单因素方差分析和u检验分析1、2及4周后4组大鼠肺泡炎、肺纤维化的评分，并分析大鼠的血小板反应蛋白1（TSP-1）、转化生长因子β1（TGF-β1）及I型胶原和III型胶原mRNA的含量变化情况。结果氨氯地平组和吡非尼酮组大鼠各时间段的TSP-1、TGF-β1及I型胶原和III型胶原mRNA的含量均低于模型组（P＜0.05），且氨氯地平组较吡非尼酮组也降低（P＜0.05），大鼠的肺泡炎和肺纤维化评分结果显示氨氯地平组和吡非尼酮组低于模型组（P＜0.05），且氨氯地平组显著低于吡非尼酮组（P＜0.05）。结论氨氯地平可能通过抑制TGF-β1、TSP-1的生成水平和减少I型胶原和III型胶原mRNA的表达达到减轻大鼠肺组织肺泡炎及肺纤维化程度的临床效果。

氨氯地平；吡非尼酮；博来霉素；肺纤维化

肺纤维化[1]（pulmonary fibrosis，PF）多累及肺间质、肺泡和细支气管。最显著特征[2-3]为Ⅱ型肺泡上皮细胞聚集、成纤维细胞（Fibroblast，FB）增生、细胞外基质增加、胶原蛋白沉积等，起病初多有肺泡及间质非特异性炎症改变，继之出现肺泡结构损害，反复发生，呈新旧病灶并存现象。该病发病率较高，传统的一线治疗药物糖皮质激素及细胞毒类药物治疗效果不好。大量文献显示[4-5]，氨氯地平能明显抑制心肌以及肾脏和肝脏的纤维化进程，故其可能对肺纤维化形成有一定的抑制作用。研究发现[6]肺纤维化大鼠模型I、III胶原mRNA含量、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）含量是增高的，但仍不能作为PF确诊的依据。而另有研究[7-8]认为血小板反应蛋白1（thrombos pondin 1，TSP1）在组织纤维化的发展中起到重要作用，可作为诊断纤维化形成的参考指标。本次实验拟通过观察氨氯地平干预下肺纤维化大鼠上述指标含量变化，以及对肺泡炎、肺纤维化的评分方面的影响，以期发现氨氯地平在肺纤维化方面的作用与可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选择健康的SD大鼠240只。材料选自西南医科大学实验动物中心，生产许可证号scxk[（川）2013-17]，鼠龄均为同批次6周大鼠，平均体重为（208±41）g。药物选择：博来霉素（15 mg/支，批号Y32480，日本化药株式会社），氨氯地平（中国大连辉瑞制药有限公司）。病理切片机（型号：LEICA KM I135德国石蜡切片机），光镜（型号：LEICA DM LB德国显微镜），日本OLYMPUS全自动显微摄像系统，Q520图像分析仪（英国Cambridge公司），MIAS-300mRNA图像分析软件（四川大学）。

1.2 建立大鼠模型

将240只健康大鼠分为4组（空白组、模型组、吡非尼酮组及氨氯地平组），每组各60只。所有大鼠喂养1周后方可进行实验，首先完成大鼠麻醉：按照0.35 ml/100 g体重行腹腔注射10%水合氯醛[9]，麻醉完成后将大鼠固定于鼠板成仰卧位，经18号气管插管完成大鼠外置气道的建立，放置碎棉絮实时监测大鼠的气道通畅情况。空白组经气道注入生理盐水（按照1 ml/kg体重），模型组、吡非尼酮组及氨氯地平组均经气道注入相同质量的博来霉素A5完成模型的制备。完毕后立即将动物直立、旋转，动物清醒可后随意进食作为模型建立成功的标准[10]。空白组和模型组经食道灌注生理盐水（按照5 mg/kg体重），吡非尼酮组及氨氯地平组（按照生理盐水∶药物=1∶1）灌注等量相应药物。所有模型建立完成后的1、2及4周分别处死4组大鼠各20只。

1.3 大鼠组织病理切片和染色

取出处死动物肺脏进行常规石蜡包埋[11]，采用病理切片机连续组织切片（厚4μm，型号：LEICA KM I135德国石蜡切片机），取切片完成HE染色和三色（Masson）染色，光镜（型号：LEICA DM LB德国显微镜）和日本OLYMPUS全自动显微摄像系统做图像采集，观察肺组织变化情况。

1.4 免疫组织化学检测TGF-β1和TSP-1

将石蜡切片行脱水脱蜡处理，70%酒精润洗行PAP法[12]染色，选择Im-30634大鼠TGF-β1免疫组织化学检测试剂盒和Im-30208大鼠血小板反应蛋白/凝血酶敏感蛋白1免疫组织化学检测试剂盒进行免疫组织化学分析（上述材料均选自上海雅吉生物科技有限公司）。对于染色结果则使用Q520图像分析仪（英国Cambridge公司）进行定量检测。高倍镜下根据不同的表达部位选择5个视野，计算平均光密度。

1.5 I型胶原和III型胶原mRNA含量检测

Northern印迹分子杂交法[13]完成对I、III型胶原mRNA的测验，方法依照杜卫东等[14]对肝纤维化α1（I）和α1（III）前胶原mRNA表达的测验，胶原重组质粒由美国Mon-li Chu博士提供。采用MIAS-300图像分析软件（材料选自四川大学）对杂交后图像进行分析，分别计算出I、III型胶原mRNA的相对含量。

1.6 肺纤维化和肺泡炎评分判断标准

参照文献评判标准[15]分为4级：0级表示无明显肺纤维化或炎症病灶出现；I级表示肺纤维化或炎症程度达全肺的20%；II级表示肺纤维化或炎症程度达全肺的20%～50%；III级表示肺纤维化或炎症程度达全肺的5%以上。

1.7 统计学方法

采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，计数资料采用频数描述。计量资料组间比较采用方差分析，对等级资料使用非秩和秩和检验（Kruskal-Wallis H检验）进行组间分析，两两比较则采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺纤维化程度（Masson染色）评分

模型组大鼠随着时间的推移，肺纤维化严重程度逐渐加重，在3个时间点对照组较空白组肺纤维化程度均加重（P＜0.05），说明建立大鼠模型成功，博来霉素对大鼠肺组织的影响明显。第1周剩余3组间的肺纤维化程度相近，差异无统计学意义（P＞0.05）；第2周时氨氯地平组纤维增生较对照组和吡非尼酮组均减轻，差异有统计学意义（P＜0.05）；第4周时氨氯地平组较模型组纤维增生减轻（P＜0.05），吡非尼酮组较模型组纤维增生减轻（P＜0.05），氨氯地平组较吡非尼酮组纤维增生减轻（P＜0.05）。见表1和图1。

表1 肺纤维化程度评分比较（n=60，例）

图1 大鼠肺纤维化Masson染色（40×10）

表2 肺泡炎程度评分比较（n=60，例）

2.2 大鼠肺泡炎程度（HE染色）评分

炎症反应的发生具有突然性，在本次试验中完成灌注后的一段时间内均有炎症出现。但空白组大鼠在3个时间段的炎症细胞浸润程度均低于其余3组（P＜0.05）。随着时间推移模型组炎症反应得到一定改善，但差异没有统计学意义（P＞0.05）；第2周和第4周时，氨氯地平组和吡非尼酮组炎症细胞浸润程度、肺泡间隔增宽范围均低于模型组（P＜0.05）。见表2。

2.3 大鼠TGF-β1和TSP-1含量

3个时间点空白组较其他3组TGF-β1和TSP-1均较低（P＜0.05）；模型组大鼠各时间点的TGF-β1和TSP-1含量均高于氨氯地平组和吡非尼酮组（P＜0.05）；且氨氯地平组较吡非尼酮组大鼠各时间段TGF-β1和TSP-1含量降低（P＜0.05）。见表3。免疫组织化学见图2。

2.4 大鼠I型胶原和III型胶原mRNA含量

3个时间点空白组较其他3组I、III型胶原mRNA含量均较低（P＜0.05）；模型组大鼠各时间点均高于氨氯地平组和吡非尼酮组（P＜0.05）；且氨氯地平组较吡非尼酮组大鼠各时间段含量降低（P＜0.05）。见表4。

表3 TGF-β1和TSP-1含量（IOD）比较（±s）

表3 TGF-β1和TSP-1含量（IOD）比较（±s）

注：1）空白组与其他3组比较，P＜0.05；2）模型组与氨氯地平组和吡非尼酮组比较，P＜0.05；3）氨氯地平组与吡非尼酮组比较，P＜0.05

组别第1周第2周第4周TGF-β1TGF-β1TGF-β1TSP-1空白组8.48±0.211）4.42±0.151）8.83±0.231）4.37±0.111）8.56±0.271）4.51±0.161）TSP-1TSP-1模型组氨氯地平组167.37±5.872）142.45±4.433）148.67±25.522）114.58±21.133）178.28±5.332）94..33±4.123）152.26±41.182）88.20±16.583）183.34±4.482）11.35±2.283）136.35±38.852）74.82±1.153）吡非尼酮组152.42±4.28133.96±22.45112.36±4.63109.01±23.3119.97±4.4520.23±0.97 F值，P值5968.410，0.000214.254，0.0005827.97，0.000122.659，0.00012852.240，0.000189.025，0.000空白组vs模型组（t值，P值）-118.06，0.000-22.795，0.000-131.053，0.000-18.654，0.000-164.521，0.000-21.456，0.000空白组vs氨氯地平组（t值，P值）-99.549，0.000-17.408，0.000-66.126，0.000-10.574，0.000-2.626，0.010-11.442，0.000空白组vs吡非尼酮组（t值，P值）-106.957，0.000-20.471，0.000-80.070，0.000-13.199，0.000-10.740，0.000-2.558，0.013模型组vs氨氯地平组（t值，P值）18.517，0.0005.387，0.00064.927，0.0008.080，0.000161.895，0.00010.014，0.000模型组vs氨氯地平组（t值，P值）11.109，0.0002.325，0.02350.983，0.0005.455，0.000153.781，0.00018.898，0.000氨氯地平组vs吡非尼酮组（t值，P值）-7.408，0.000-3.063，0.003-13.944，0.000-2.625，0.010-8.114，0.0008.884，0.000

图2 TGF-β1和TSP-1免疫组织化学染色（40×10）

表4 I、III型胶原mRNA含量比较（±s）

表4 I、III型胶原mRNA含量比较（±s）

注：1）空白组与其他3组比较，P＜0.05；2）模型组与氨氯地平组和吡非尼酮组比较，P＜0.05；3）氨氯地平组与吡非尼酮组比较，P＜0.05

组别第1周第2周第4周I型I型I型III型空白组0.57±0.061）0.68±0.101）0.56±0.051）0.67±0.091）0.56±0.081）0.66±0.111）III型III型模型组氨氯地平组0.77±0.052）0.64±0.053）0.89±0.112）0.76±0.083）0.81±0.042）0.65±0.073）0.95±0.112）0.81±0.103）0.88±0.052）0.63±0.043）0.99±0.122）0.74±0.083）吡非尼酮组0.71±0.040.83±0.070.74±0.110.88±0.080.77±0.090.81±0.10 F值，P值58.758，0.00019.641，0.00044.739，0.00031.238，0.00088.029，0.00036.923，0.000空白组vs模型组（t值，P值）-12.525，0.000-7.267，0.000-10.885，0.000-9.257，0.000-14.840，0.000-10.077，0.000空白组vs氨氯地平组（t值，P值）-4.384，0.000-2.769，0.007-3.919，0.000-4.628，0.000-3.246，0.000-2.443，0.000空白组vs吡非尼酮组（t值，P值）-8.767，0.000-5.191，0.000-7.837，0.000-6.942，0.000-9.739，0.000-4.580，0.000模型组vs氨氯地平组（t值，P值）8.141，0.0004.499，0.0006.966，0.0004.628，0.00011.594，0.0007.634，0.000模型组vs氨氯地平组（t值，P值）3.757，0.0002.076，0.0413.048，0.0032.314，0.0235.101，0.0005.496，0.000氨氯地平组vs吡非尼酮组（t值，P值）-4.384，0.000-2.422，0.018-3.919，0.000-2.314，0.023-6.492，0.000-2.138，0.000

3 讨论

氨氯地平是一种长效的钙离子拮抗剂，半衰期约23 h，除了其可靠的降动脉压及极低的毒副作用以外，它在逆转心肌的纤维化也有不俗的表现，可能与其抑制早期增生反应基因c-myc、c-fos和c-jun和激活抗增生基因有关[16]。另外，也有资料表明氨氯地平可一定程度改善肾纤维化，可能是因为其能抑制由血管紧张素II（AngII）及血小板衍生生长因子（PDGF）诱导的SHR大鼠肾小球系膜细胞的肥大与增殖有关[17]。氨氯地平在肝纤维化的减轻也有值得称道的地方。因此，本研究认为在肺纤维化方面，氨氯地平也有可能起到抑制肺纤维化发展的作用。尽管在既往的研究中发现[18]，肺纤维化大鼠模型I、III胶原mRNA含量、TGF-β1含量是增高的，但仍不能作为PF确诊的依据。研究[19]中发现肾小管间质纤维化进展过程中，TSP1表达显著上调，其改变程度与肾功能损害密切相关。学者们根据肾间质与肺间质在组织学发生上的同源性[20]，考虑在肺纤维化的进程中，是否存在TSP1的密切相关以及在其诊断中的地位的研究已成为组织纤维化研究中新的热点。TSP1又称血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白，由789个氨基酸残基组成，存在于血小板的α颗粒体和内皮细胞Weibei-Palade小体（棒状小体）内，在化学因子刺激下，α颗粒体和棒状小体迅速与胞膜融合而在细胞膜上表达，介导白细胞与内皮细胞的起始黏附，在炎症和血栓形成等方面起重要作用。

在本次实验研究中发现，空白组TSP-1、TGF-β1及I型胶原和III型胶原mRNA含量较其他3组均低，说明大鼠注入博来霉素后的一段时间内TSP-1、TGF-β1的表达均增加，且I型、III型胶原mRNA的转录翻译增强。而氨氯地平组和吡非尼酮组大鼠各时间段的指标含量低于模型组，且氨氯地平组较吡非尼酮组也降低，说明两种药物对上述指标的表达有抑制作用且氨氯地平效果较吡非尼酮更显著，而实验最后两组的上述指标水平未为达到正常水平可能的原因是注射博来霉素对大鼠肺组织带来不可逆性损伤或者是实验时间不够长，药物未达到最终疗效。而大鼠肺组织纤维化masson染色和肺泡炎的HE染色显示大鼠的肺泡炎和肺纤维化评分结果显示：空白组较其余3组较轻，而氨氯地平组和吡非尼酮组低于模型组，且氨氯地平组低于吡非尼酮组（P＜0.05）也证实上述观点。

综上所述：氨氯地平对于人工注射博来霉素形成的肺组织纤维化和肺泡炎抑制作用显著，可能与抑制TSP-1、TGF-β1的表达和抑制I型胶原和III型胶原mRNA的转录翻译有关系，为氨氯地平药物疗效的临床研究和临床使用提供参考。

本次实验的不足之处在于：①忽略气管灌注对大鼠本身肺组织带来的损伤；②实验时间过短，导致药物疗效的证明存在弊端（无法确定药物是否能治愈肺纤维化），应适当增加时限；③实验分组存在不科学性：可增加氨氯地平和吡非尼酮药物联合使用组，证实单独使用氨氯地平的临床疗效。

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（张蕾 编辑）

Effect of Amlodipine on pulmonary fibrosis in rats*

Ju-ping Chen,Xiu-fang Luo,Ming-xin Liu,Xian-ming Fan,Wen-jun Wang,Xiao-qin Zhan
(Department of Respiratory Medicine,the Affiliated Hospital,Southwest Medical University, Luzhou,Sichuan 646000,China)

Objective To study the protective effect of Amlodipine on pulmonary fibrosis in rats and the possible molecular mechanism,so as to find new ways for the treatment of pulmonary fibrosis.Methods Totally 240 rats were divided into control group,model group,Pirfenidone group and Amlodipine group at random.The rats in the model group,Pirfenidone group and Amlodipine group were perfused with Bleomycin through trachea to build the model of pulmonary fibrosis,those in the control group were perfused with saline.Then the rats in the control and model groups were given normal saline,but the rats of the Amlodipine group and the Pirfenidone group were treated with half volume of Amlodipine and Pirfenidone respectively together with half amount of normal saline.Single factor analysis andUtest were used to analyze the pulmonary fibrosis score and alveolitis score at 1,2 and 4 weeks in the 4 groups,and also the content of thrombospondin 1(TSP-1),TGF-β1and mRNA of type I collagen and type III collagen was analyzed.Results The four indexes in the Amlodipine group and the Pirfenidone group were significantly lower than those in the model group at each time point(P＜0.05),they were obviously lower in the Amlodipine group than in the Pirfenidone group(P＜0.05).The alveolitis and pulmonary fibrosis scores in the Amlodipine and Pirfenidone groups were significantly lower than those in the model group(P＜0.05),and they were obviously lower in the Amlodipine group than in the Pirfenidone group(P＜0.05).Conclusions Amlodipine can significantly reduce lung alveolitis and pulmonary fibrosis,possibly through inhibition of TGF-β1and TSP-1 and reduction of type I and III collagen mRNA expression.

Amlodipine;Pirfenidone;Bleomycin;pulmonary fibrosis

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.22.001

1005-8982（2016）22-0001-06

2016-05-28

四川省卫生厅项目（No：110343）