阿奇霉素胶囊新版药典微生物限度检查方法的建立

刘绪平肖钦钦陈 希张春华李景莲.江西省药品检验检测研究院 江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西南昌 330029；2.南京军区南昌药品器材供应站，江西南昌 330029

阿奇霉素胶囊新版药典微生物限度检查方法的建立

刘绪平1肖钦钦1陈 希1张春华1李景莲2▲
1.江西省药品检验检测研究院 江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西南昌 330029；2.南京军区南昌药品器材供应站，江西南昌 330029

目的 建立阿奇霉素胶囊微生物限度检查法并进行方法学验证。 方法 按《中国药典》2015年版四部制剂通则1105、1106、1107项下要求进行试验。霉菌和酵母菌检查采用平皿法，需氧菌总数检查采用薄膜过滤法，大肠埃希菌检查采用薄膜过滤法，采用上述方法对阿奇霉素胶囊各试验菌进行回收试验测试及对控制菌检查方法进行验证。 结果 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数验证试验中各菌的回收比值均符合《中国药典》2015年版规定，控制菌检查方法可行。结论 该方法适用于阿奇霉素胶囊的微生物限度检查。

阿奇霉素胶囊；微生物限度；平皿法；薄膜过滤法；方法学验证

阿奇霉素为十五元环大环内酯类抗生素[1]，抗菌谱广，对流感杆菌、淋球菌、化脓性链球菌等细菌具有显著的抗菌效果[2]，因此对多种常见细菌感染疾病具有良好的抗菌作用[3]。如用于治疗敏感细菌引起的鼻窦炎、中耳炎、咽喉炎、肺炎等，用于旅行者腹泻和其他肠道感染[4]，用于沙眼衣原体及非多种耐药淋病奈瑟菌所致的尿道炎和宫颈炎，也可与其他药物一起用于治疗疟疾[5-7]。随着阿奇霉素在临床上的应用越来越广泛，为使临床用药更加安全有效，实施微生物限度检查是确保药品卫生质量的重要途径[8-9]。

《中国药典》2015年版的微生物限度检查法与2010 年版相比其在培养基、培养条件、检验方法、微生物限度标准等上都有较大改变。如在进行非无菌产品微生物限度检查时，需采用适当的方法来消除或抑制药物的抗菌活性，以保证方法的适用性，2010年版收载方法有稀释法、薄膜过滤法、中和法、离心沉淀法或几种方法联合使用，而《中国药典》2015年版四部[10]中删除了离心沉淀法。本研究参考《中国药典》2015年版四部方法，建立了阿奇霉素胶囊的微生物限度检查方法，该方法可为其他大环内酯类抗生素药物微生物限度检查法的建立提供参考，同时为药品检验机构及生产企业建立品种2015年版药典微生物限度检查法提供借鉴。

1　仪器与材料

1.1仪器

MLS-3780高压消毒灭菌柜（日本三洋公司）；1384 4'BSC 生物安全柜（美国赛默飞世尔科技有限公司）；PYX-DHS 细菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；KB400 霉菌培养箱（德国BINDER公司）。

1.2供试品

阿奇霉素胶囊（批号：151101、160101、160102），由江西保利制药有限公司提供。

1.3菌种

枯草芽孢杆菌[CMCC（B） 63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B） 26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、大肠埃希菌[CMCC（B） 44102]、白色念珠菌[CMCC（F） 98001]、黑曲霉[CMCC（F） 98003]，以上菌种均购自中国食品药品检定研究院。

1.4培养基

胰酪大豆胨液体培养基，批号160119；胰酪大豆胨琼脂培养基，批号160128；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号160119；沙氏葡萄糖液体培养基，批号151222；麦康凯琼脂培养基，批号151124；麦康凯琼液体培养基，批号151102；pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。（以上培养基均来源于北京陆桥技术有限责任公司。）

2　验证方法

2.1试验菌株菌液制备

取经35℃培养24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌新鲜培养物1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-2～10-6； 取经25℃培养48h的白色念珠菌新鲜培养物1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-2～10-3；取经25℃培养7d的黑曲霉新鲜培养物，加5mL 含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1mL，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液适量稀释，取1mL稀释后的孢子悬液，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍稀释至10-2～10-3，做活菌计数备用[9]。

2.2供试液制备

称取本品10g，置无菌锥形瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，于45℃水浴保温振荡15min，混匀，作为1∶10供试液；取10mL，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，摇匀，作为1∶100供试液，备用。

2.3微生物计数方法适用性试验

需氧菌总数计数：取1∶100供试液1mL，采用薄膜过滤法进行过滤，每筒用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500mL冲洗，在最后100mL冲洗液中加入不大于100cfu的相应试验菌，冲洗后取出贴膜于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，置规定温度下培养24～72h，逐日观察结果。

霉菌和酵母菌总数计数：取1∶10供试液9.9mL，加入适宜浓度的试验菌液0.1mL，混匀，使每1毫升供试液中含菌量不大于100cfu。取1mL注入平皿，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，置规定温度下培养24～120h，逐日观察结果。

供试品对照组：取1∶10供试液9.9mL，以稀释液代替菌液，同法操作。

菌液对照组：取稀释液代替供试液，同法操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。

结果：5株需氧菌、2株真菌的回收比值均在0.5～2之间，符合药典规定，因此可照此方法进行阿奇霉素胶囊的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。见表1。

表1　需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法学验证结果

2.4控制菌检查方法的验证[11]

根据《中国药典》2015年版要求，控制菌检查只需检查大肠埃希菌。

试验组：取1∶10的供试液10mL，采用薄膜过滤法，每筒用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500mL冲洗，在最后100mL冲洗液中加入不大于100cfu的大肠埃希菌1mL，加至100mL胰酪大豆胨液体培养基中，置35℃培养18～24h，取上述培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，42℃培养24～48h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～72h。取麦康凯琼脂平板上经纯化后的培养物，接种至含5mL MUG培养基的试管内，培养，于5h、24h在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。阴性对照组：取稀释液1mL照大肠埃希菌检查法操作。结果：试验组检出大肠埃希菌，阴性对照试验组无菌生长。

3　讨论

阿奇霉素作为第二代大环内酯类抗生素，抗菌谱更广泛，尤其对需氧菌和厌氧菌的抗菌能力更加显著。在建立阿奇霉素的2010年版微生物限度检查法时，多篇文献[12-13]报道方法均采用了低速离心和薄膜过滤相结合的方法来消除其抑菌作用。相比之下，本研究参照《中国药典》2015年版所建立的阿奇霉素胶囊微生物限度检查法操作更简单，且薄膜过滤时所用缓冲液的冲洗量相对减少，有利于节约成本，同时能有效消除供试品杀菌和抑菌作用，保证试验结果的准确性和科学性。

本研究在进行需氧菌总数计数方法学验证时，先选取敏感菌株枯草芽孢杆菌进行试验，取1∶10供试液采用薄膜过滤法进行过滤，每筒分别用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1000mL冲洗，回收比值均为0；当取1∶100供试液1mL，照上述方法进行薄膜过滤，每筒冲洗量500mL时，枯草芽孢杆菌的回收比值为1.0，后者的回收比值符合药典规定。经方法适用性验证结果表明，阿奇霉素胶囊需氧菌总数检查可采用薄膜过滤法[14]（取1∶100的供试液1mL，每膜冲洗500mL，100mL/次）。

大肠埃希菌作为粪便污染的指示菌，它是肠杆菌科各族细菌中检出率最高的菌种[15]，如果检出大肠埃希菌，表明样品存在被粪便污染的可能性，有可能污染肠道疾病菌，人们食用了这样的药品则可能引起消化道传染病。经过验证，大肠埃希菌检查采用薄膜过滤法（每膜冲洗500mL，100mL/次），有效消除供试品自身杀菌和抑菌作用，大肠埃希菌试验结果更为准确。

药品污染微生物直接影响药品的有效性，且污染微生物还可能产生毒素[16]，可能危及用药患者的生命安全。药品微生物限度是控制药品质量的重要指标之一，《中国药典》从2005年版开始要求进行药品微生物限度方法学验证，规定采用适当的方法来消除或抑制药物的抗菌活性，以保证方法的适用性，保证了药品微生物限度试验结果的准确性和科学性，从而保证了药品质量的安全性和有效性。

[1] 国家药典委员会.中国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 刘素霞.阿奇霉素的药理及其临床应用观察[J].甘肃科技，2014，30（21）：129-130.

[3] 胡掌珠，吴谨，张健，等.阿奇霉素治疗感染性疾病的临床疗效评价[J].中国医院用药评价与分析，2016，2（16）：276-278.

[4] 赵楠.阿奇霉素治疗急性肠炎的临床效果评价[J].基层医学论坛，2014，18（26）：3476-3477.

[5] Thriemer K，Starzengruber PK，Haque R，et al. Azithromycin combination therapy for the treatment of uncomplicated falciparum malaria in Bangladesh：an open-label randomized，controlled clinical trial [J].The Journal of Infectious Diseases，2010，202（3）：392-398.

[6] Taylor WR，Richie TL，Fryauff DJ，et al.Tolerability of Azithromycin as Malaria Prophylaxis in Adults in Northeast Papua，Indonesia [J].Antimicrobial agents and chemotherapy，2003，47（7）：2199-2203.

[7] Chico RM，Chandramohan D.Azithromycin plus chloroquine combination therapy for protection against malaria and sexually transmitted infections [J].Expert opinion on drug metabolism & toxicology，2011， 7（9）：1153-1167.

[8] 达朝荣，陈建强.药品微生物限度检验误差影响因素分析[J].北方药学，2016，13（1）：177-178.

[9] 张丽娜.2012-2015年度我市药品微生物限度检查质量分析[J].生物技术世界，2016，1（16）：212.

[10] 国家药典委员会.中国药典（四部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

[11] 张文婷，刘绪平.牛黄上清胶囊微生物限度检查方法的验证[J].药物分析杂志，2009，11（11）：1961-1963.

[12] 徐巍巍，肖利红，姚福鑫.二代大环内酯类抗生素微生物限度检查法研究[J].煤炭与化工，2015，38（8）：75-77，107.

[13] 张俭俭，田志国.阿奇霉素胶囊微生物限度测定及方法学验证[J].药物分析，2011，13（3）：540-542.

[14] 肖建华，周修森.酮康唑尿素乳膏微生物限度检查方法的建立[J].海峡药学，2015，27（10）：76-77.

[15] 马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册 [S].北京：科学出版社，2001.

[16] 胡昌勤，杜平华，许华玉.实用药品微生物检验检测技术指南 [S].北京：人民卫生出版社，2015.

Establishment of microbial limit test method for Azithromcin Capsule Chinese Pharmacopoeia 2015

LIU Xuping1XIAO Qinqin1CHEN Xi1ZHANG Chunhua1LI Jinglian2
1.Jiangxi Institute For Drug Control, Jiangxi Provincial Engineering Research Center for Drug and Medical Device Quality, Nanchang 330029, China; 2.Nanchang Pharmaceutical Equipment Supply Station of Nanjing Military Region, Nanchang 330029, China

Objective To establish a method of microbial limit test for Azithromcin Capsule. Methods According to 1105, 1106, 1107 of Chinese Pharmacopoeia 2015 method, total combined yeasts and molds count were checked by plate count (1∶10 solution), total aerobic microbial count was checked by membrane filtration method, and escherichia coli was checked by membrane filtration method. Results Recovery ratio of each test bacteria was in line with Chinese Pharmacopoeia 2015. Escherichia coli could be detected in the positive control. Conclusion This method can be used for microbial limit test for Azithromcin Capsules.

Azithromcin capsule; Microbial limit test; Pour plate method; Membrane filtration Method; Method validation

R927.11

A

2095-0616（2016）17-37-03

▲

（2016-07-07）