木质纤维预处理方法及基质的变化与检测

曾 勇， 江 皓， 李 江， 聂 红， 丁江涛， 周红军

(中国石油大学(北京)新能源研究院， 北京 102249)



木质纤维预处理方法及基质的变化与检测

曾 勇， 江 皓， 李 江， 聂 红， 丁江涛， 周红军

(中国石油大学(北京)新能源研究院， 北京 102249)

大量用于发酵的生物质诸如秸秆和废弃木材中含有丰富的纤维素、木质素等难以降解的高分子有机质，直接利用会在发酵过程中产生启动缓慢、发酵周期长、有机质利用率低等问题。在发酵前对底物进行必要的预处理是提高发酵效率的有效措施，而在预处理过程中，掌握底物的变化情况、分析预处理水解液的成分对探索预处理的作用机理和处理效果至关重要。文章对已有的预处理方法进行了综述，并介绍了最新的研究进展和发展方向，介绍了分析底物变化时所采用的方法，并进行比较，进而展望了预处理手段在沼气工业化中的应用前景。

厌氧发酵；生物能源；预处理；化学分析

沼气是种多功能用途的可再生能源，可直接用做家用燃料，亦可进行提纯、除杂后进入天然气管网用于发电、压缩制车用燃气等[1-3]。秸秆作为可再生资源，是生产沼气的主要原料之一，它来源广泛，产量巨大[4]，仅在中国，每年就产生7亿多吨秸秆作物[5]，由于没有得到有效利用，在废置过程中既对环境造成很大的污染，又造成了有机质的浪费[6]。

秸秆是由多种有机质构成的物质，其中纤维素含量为40%～50%，半纤维素为25%～35%，木质素为15%～20%[7]。这些木质纤维素原料是以己糖(C-6)和戊糖(C-5)为基本单位的有机高分子，是世界范围内最大的单糖资源[8]，如能用于发酵生产生物燃料，每年可产生约30 EJ能量，占世界总能源的7.5%[9]。木质素、纤维素广泛的存在于植物细胞壁中，在发酵过程中，这些植物的“铜墙铁壁”会阻止微生物所产生的水解酶接近、透过植物细胞，严重影响水解过程的进行[10]。造成厌氧发酵启动时间过长(10 d)、停留时间过长(20～50 d)和有机质降解率低(<50%)等一系列问题，极大的影响了发酵效率[11]。

整个厌氧发酵过程，广泛认同的可划分为三个阶段：水解阶段、酸化阶段、产甲烷阶段[12-13]；诸多学者也已证明，在整个厌氧发酵过程中，水解步骤为限制步骤，水解速率的快慢直接影响整个发酵过程的效率[7, 14-17]。因此，在进行厌氧发酵、生产生物燃气的前期，对发酵底物进行有目的性的预处理是十分必要的，预处理的结果又可指导预处理方法的改进和提高(见图1)。

预处理可破坏底物的物理结构和改变其化学特性，为水解阶段的水解酶提供有利的环境条件，可加速水解的进行，进而提高整个厌氧发酵的效率；此外，因为底物的微观结构发生了变化[18]，微生物利用有机质的效率也将得到大幅度的提升，产气量有了明显的提高[19]。Maryam M Kabir[20]等人以N-甲基吗啉-N-氧化物(NMMO)为溶剂对含大量纤维素的底物进行预处理后，甲烷产气量提高了100%。

图1 预处理在发酵工艺中的应用

无论是机械法预处理还是化学法预处理，底物的自身结构、化学特性等都会产生明显的变化[21-22]。在预处理过程中测试预处理水解液的成分、分析底物的变化情况对探索预处理方法作用底物的机理和预处理对后续发酵的影响至关重要；而在众多的预处理手段中，针对底物的变化情况的研究和分析侧重点也是各有不同(见表2)。有的底物发生改变时易在固相中了解到改变的程度和原因，而有的底物发生改变时，通过液相的分析则更为直观。笔者对现有的一些预处理方法进行了归纳，介绍了最新的预处理方法和发展方向；集中了预处理过程中底物的分析方法和测试内容，对比了不同预处理方法对固相、液相以及水解过程的影响，并对预处理技术的应用前景提出了展望。

1 常用的木质纤维素预处理方法

木质素和纤维素是一种难溶于水的有机质，一般认为纤维素是由己糖单体构成；木质素主要则含有对羟苯基丙烷( phydroxyphenyl propane，H) 和紫丁香基丙烷( syringyl，S)、愈创木基丙烷( guaiacyl，G) 3种单体，对应的前驱体分别是香豆醇、芥子醇和松柏醇。木质素是这些单体通过脱氢聚合，由C—C 键和C—O键等连接无序组合而成[23]。而这些单体又是重要的化学中间品，如果以植物为原料得到，将大幅度降低后续产品的价格，其优势非常明显，因而近年来，针对木质素和纤维素的应用得到了极大的关注[24-25]。

但是木质素、纤维素是含有环类有机结构的、空间构成复杂的物质，直接利用困难[26-27]，采用各种预处理方法后，可使底物产生化学和物理变化，为木质纤维素的后续利用创造有利条件(见表1)。

表1 不同预处理方法对秸秆的影响[28-30]

注:“1”: 有较强影响; “—”:不确定; “0”: 有较小影响

传统的预处理方式如机械研磨、酸碱浸泡等工艺经过长久的发展，在预处理手段上得到了许多经验和成功，并在工业应用中取得了良好的收益[31-32]，许多学者也对这些预处理工艺进行了详细、全面的分析比较[33-35]。但是随着技术的更新和对环境保护意识的增加，这些方法的弊端也逐渐显现出来。如球磨法能耗高，酸碱法处理底物时将造成大量的有机质损失，预处理液含有高浓度盐，难以被发酵菌利用，排放到环境中又将造成污染。所以低能耗、对环境友好的预处理工艺得到了关注，也逐渐发展起来，预处理工艺形成了阶段式的发展模式(见表2)。

离子液在处理秸秆类底物的时候，具有良好的穿透性、不易挥发、可回收利用等优点，因为近年来被广泛应用[36, 37]。Jing[38]等人用氯化(1-丁基-3-甲基咪唑)([Bmim]Cl)与二甲基亚砜(DMSO)组成的离子液对水葫芦进行预处理，预处理温度为120℃，时间为120 min。经过预处理后的底物中，纤维素含量增加了27.9%，而49.2%的木质素被去除，相对于没有预处理的底物而言，预处理后的底物甲烷收率提高了97.6%。

表2 预处理工艺的发展与对比

有机溶剂具有良好的溶解性、高沸点、可降解等优势，联合其他工艺对生物质进行预处理时表现出了优异的性能[39, 40]。硫酸预处理是一种常见的方法，酸体系会向木质素、纤维素提供H+，从而使得高分子有机物变得不稳定而趋向于水解[41]，酸浓度普遍在1.0%～4.0%(wt)之间[33]。在最新的预处理研究中，以催化酸-溶剂所构成的预处理体系得到了应用。溶剂可分离预处理过程的中间产物，防止其沉淀在底物上，因此该种预处理方法在纤维素水解上表现出了优异的效果。

Luterbacher[42]的研究团队通过加入高沸点、无毒可降解的有机溶剂γ-戊内酯(γ-GVL)后，硫酸浓度降低至0.05%(wt)，可溶性有机质的收率增加至95%，转化率有了极大的提高。

针对植物体内木质素、纤维素和半纤维素相互交错、相互保护的特性，研究人员用草酸作为催化酸，以2-甲基-四氢叶酸(2-MTHF)为溶剂对秸秆类底物进行预处理，此类预处理方法可有效地分离3种组分：木质素进入有机相，半纤维素水解后进入水相，纤维素果浆以固相形式保留下来，后续经过简单的处理即可得到3种目标产物[43]。

新型预处理方法能有效的提高底物的降解速度，但是因为所采用的溶剂往往具有较高的工业价值，所以这类预处理方法的成本相对于传统的预处理方法而言比较高(见表2)，现阶段的工业化推广、应用受到了限制。

2 预处理后基质的变化及分析方法

2.1 可溶性有机质的变化

较为传统的预处理方法如机械预处理法，可使底物破碎，植物细胞内的有机质成分得到了一定释放；此外这类方法还可以减小粒径，增大底物表面积，为微生物利用底物提供了更多“空间”；同时纤维结晶度也随之发生着变化，使得细胞壁的结构变得不再稳定而趋向于水解，可溶性有机质含量增加(见图1)，增大了微生物的作用效率，因此该类方法可提高产气量[44-45]。其他预处理方法的目的类似，主要意图还是增加可溶性有机质的含量，减少微生物分解底物的时间、提高发酵效率，所以在预处理过程中，对可溶性有机质进行分析是评估预处理可行性的主要手段[46]。

预处理过程中底物受到外力的作用会产生“破碎效应”，在这一过程中有机质也得到了很大的释放，因此在评价预处理效果时，许多学者研究了粒径与可溶有机质之间的关系。Esposito[47]等研究了底物预处理后，粒径对发酵过程的影响，他认为更大的底物粒径将导致更低的化学需氧量(chemical oxygen demand，COD)；Kim[30]等人也进行了类似报道，文中称，底物粒径与微生物利用底物效率成反比例关系，即底物粒径越大，微生物利用率越低[48]。因此为了得到更小的底物粒径，可用各种机械物理法如超声粉碎、高速离心、液体剪切、侵蚀、高压高速搅拌、液体粉碎等对底物进行预处理，可提高底物的可溶性有机质的含量。

底物与高硬度的物体(铁球、铁珠)混合后，在机械力的作用下，可有效减少底物的粒径，提高可溶性有机质的含量，达到加速水解的目的[49]。餐厨垃圾具有高蛋白质、少木质纤维的特点，故在预处理过程中可溶性有机物变化更为明显。Izumi[50]等人用球磨法来处理餐厨垃圾，研究了餐厨垃圾的粒径与产气量之间的关系。餐厨垃圾经球磨机处理后，粒径由原来的0.843 mm降低到0.391 mm，可溶性物质占到全部COD的40%，甲烷产气量增加了28%。结合扫描电镜(SEM)和液相色谱(LC)分析发现，过度的减少底物粒径(<0.7 mm)将导致挥发性脂肪酸(VFA)的增加，甲烷产气量也因此降低。

Joo-Hyun Jang[51]等人则用微波、强碱联合处理法对底物进行预处理。底物在碱浓度为20 meqNaOH·L-1，微波预处理温度在135℃的条件下维持10 min，研究了在不同水力停留时间下产甲烷量、有机质去除率的相关情况。结果表明，经预处理过后的有机质溶解率(53%)较未经预处理(3%)的提高了18倍，甲烷最高收率提高了205%，而所有底物的有机质去除率都会因水力停留时间的减少而减小。Kim[52]等人用超声-碱液联合法对污泥进行预处理，侧重分析了该过程中可溶性物质的变化对发酵过程的影响。在试验中用氧化法测试可溶性有机质发现，可溶性有机质随着预处理强度的增加而增加；在经较低强度的预处理后(pH值9，超声5 min)，甲烷产生量提高了91%；但是在经较强的预处理后(pH值13，超声60 min)，甲烷产量只提高了25.8%，即一味提高有机质溶解量并不能提高甲烷收率。

2.2 固相的变化

各种预处理方法直接作用于底物，底物在物理和化学性质上都会发生较大的改变，对固相的分析可以非常直观的知道底物在预处理前后的变化，并为后续的生物质提炼、发酵提供数据支持。

Teghammar[53]等人采用有机溶剂NMMO浸泡秸秆和林木废弃物，分析了底物内部和表面的变化情况。他们提出，若用传统的BET氮气吸附法测试预处理后的底物，并不能为后续发酵提供有力的支持，因为作用底物的水解酶存在一个较大的空间体积，并不能通过所有的孔道。而橘红色染料的尺寸与水解酶相当，故可以用橘红色染料来模拟水解酶，并用分光光度计分析了橘红色染料吸光度的变化；若底物能吸附橘红色染料，水解酶也能通过孔道，进入到底物内部进一步作用底物。最后实验证明，秸秆经过溶剂浸泡1，3，15 h过后，较没有预处理的底物，吸光度分别降低了71%，88%，161%。红外分析秸秆的纤维素晶体发现，越长的预处理时间最后底物中的晶体含量越少，预处理15 h后的底物中，纤维素晶体含量下降了60%；而纤维素晶体含量的改变又会影响到水解酶作用底物，因为经预处理后，底物变得疏松而有利于水解酶的进入。此外，笔者还用二次离子飞行时间质谱(ToF-SIMS)测试底物表面物质的变化，结果发现，木质素的含量明显减少，而木质素被认为是微生物最难分解的物质之一[54]。

对于一些较为特殊的生物质，需有针对性的选择测试项目，如Sampedro[55]等人研究了经热蒸汽预处理后的橄榄残渣的特性。在分析固体中油脂含量时发现，经过热处理后的固体残渣中的油脂并没有被破坏，并且预处理起到了富集油脂的作用，油脂含量上升了20%～30%；LC分析预处理液中的酚类发现，经预处理后的固相中的酚类进入到了液体中，证明预处理可有效的去除固相底物中对发酵菌不利的酚类，提高了固体残渣的利用率。

Sang[56]等人集中研究了秸秆类底物经不同浓度NaOH(5%，10%，15%，20wt%)和高压CO2(40～50 bar)预处理后的变化情况，并用多种方法进行了评估。红外测试表明，经预处理后的底物中的大部分键的峰值变得更大；3352 cm-1处的峰分裂、转化为三处纤维素I的特征峰和四处纤维素II的特征峰。X衍射分析纤维素晶体粒径时发现，经CO2预处理后的底物中的纤维素II晶体粒径小于NaOH预处理的纤维素I晶体粒径。但是比较两种预处理后的纤维素II晶体粒径时，用CO2预处理的纤维素II晶体粒径更大。Sibel Yildiz 则研究了在强热环境中木质纤维素三斜晶系(Iα)和单斜晶系(Iβ)之间的关系[57]。用红外光谱分析预处理后的底物表明，不仅预处理温度对Iα/Iβ影响较大，预处理时间同样对Iα/Iβ有着较强的影响；同时还验证了单斜晶系是纤维素晶体中的最主要部分。

2.3 水解过程的变化

在前文提到了水解步骤为发酵过程的限制步骤，水解阶段中微生物产生的水解酶作用底物后，可把大分子分解为低聚分子或小分子物质，为后续阶段提供可利用的原料(见图2)。正是因为水解阶段的重要性，生物质在经预处理后，探讨预处理对水解过程造成的影响就十分必要。

图2 微生物水解和酸化有机质过程

发酵菌在水解阶段会产生大量的水解酶，大分子有机物必须要酶解成小分子糖或有机酸以后才能被继续利用。Silva[58]等人研究了小麦秸秆研磨后，酶水解过程与糖含量之间的关系。他们用喷射研磨法处理小麦秸秆，使其粒径大幅度下降，用激光衍射粒度分析仪分析发现，粒径最多能降低至100 μm。酶解此底物，总糖含量增加了36%，葡萄糖含量增加了40%。用球磨法改进工艺后，可使秸秆粒径进一步降低，总糖含量提升了46%，葡萄糖含量增至72%；用广角X射线散射分析纤维素结晶度时发现，随着预处理的进行，纤维度结晶度也随之从22%降至13%。

Guillaume Pierre[59]等人则研究了水解酶对强热预处理后的微晶纤维素和啤酒花粒的作用情况。实验表明，经预处理后的微晶纤维素的酶解初速率和最后的水解产率较未预处理的底物更低，作者指出原因可能是预处理过程中有晶体结构的变化和抑制物的产生。而啤酒花粒在预处理过后，酶水解的收率明显提高，用扫描电镜分析其表面情况发现，预处理后的啤酒花粒表面有了明显的断裂层。

Huadong Peng[60]等人研究了底物经球磨处理后，水解酶与微晶纤维素之间的关系。用紫外可见分光光度计测试葡萄糖含量后发现，经球磨处理后的底物葡萄糖产量有所增加；但是比较球磨3 h与6 h的底物时发现，经水解酶作用后所产生的葡萄糖总量相当。在分析纤维素结晶度、有机高分子聚合度和粒径三者对水解速率的影响后发现，纤维素结晶度对水解速率的影响最大。

而随着计算机技术的提升，用数学方法对水解过程进行模拟分析、考察预处理工艺对水解过程的影响也被广泛采用[61]。Z Maache-Rezzoug[62]等人用相应面法(Response Surface Methodology, RSM)研究了用水热法预处理小麦秸秆时，秸秆含水率(10%～40%)、压力(300～700 kPa)和处理时间(3～62 min)对水解过程的影响。方差分析(ANOVA)显示，处理过程的压力以及时间对秸秆的水解收率和水解启动时间影响最大；而模拟的水解收率和启动时间与实验数据的结果的R2值为96%和86%，证明此类方法可以很好的预测预处理工艺参数对水解过程的影响。

3 结论与展望

就目前而言，大部分学者在研究预处理对底物的影响时，通常会分析预处理方法对底物表面积、纤维素结晶度、秸秆孔隙等特性的影响。还有学者针对预处理前后和发酵前后底物中纤维素含量的变化进行了分析，探索预处理对纤维素降解的贡献。对于某些特殊的底物，研究人员也会有针对性的进行分析。

对预处理底物和水解液详尽而全面的分析评估，可以更好的了解预处理的作用机理，提出更为有效预处理方法，从而提高发酵效率，增加产能和经济效益[63-64]。随着发酵工艺的日渐成熟和生物质能源工业的发展，底物的日处理量也随之剧增，必要的预处理可保证发酵系统稳定运行[65-66]，所以预处理在整个生物质能源领域的运用前景是十分广阔的。今后笔者的研究重点包括： 1)把最新的木质纤维素水解基础研究与发酵工程相耦合，实现“理论到实际应用的过度”，提高秸秆类生物质的利用途径和发酵效率；2)扩展对预处理过程底物变化的评估，采用多种评估方法较为全面的对预处理过程进行分析，特别是要把液相和固相的分析相结合起来；3)结合预处理过程的分析，找到发酵过程中因预处理成分不同而带的影响，从而调整预处理工艺，向利于发酵过程转变；4)开发和研究低能耗、环境友好的预处理工艺，重点控制使用成本，利于规模化、工业化。

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Pretreatment Methods of Lignocellulose and Substrate Changes

ZENG Yong， JIANG Hao， LI Jiang， NIE Hong， DING Jiang-tao， ZHUO Hong-jun

(Institute of New Energy, China University of Petroleum, Beijing 102249,China)

Straws and waste wood can be utilized for anaerobic fermentation producing biogas, but their high contents of cellulose and lignin are difficult to degrade and need pretreatment. In this paper, various pretreatment methods, including chemical, physical, mechanical methods, were discussed. And the methods of analyzing the change of substrate after pretreatment were introduced in detail and compared. Further more, the application of pretreatments in biogas industrialization was prospected.

anaerobic fermentation；cellulose; lignin; pretreatment；chemical analysis

2015-04-08

项目来源： 国家高技术研究发展计划“863”计划(2012AA063507)

曾 勇(1990-)，男，硕士，主要从事生物质能源研究等工作，E-mail:zengyong1990@hotmail.com

X71；TE992.3；O657

A

1000-1166(2016)01-0050-08