采用Biolog法分析餐厨垃圾厌氧消化微生物群落多样性

梅 冰, 彭绪亚， 谢 影

(1．云南农业大学 云南农业大学节能减排检测工程中心， 昆明 650000；2.重庆大学， 重庆 400045)



采用Biolog法分析餐厨垃圾厌氧消化微生物群落多样性

梅 冰1, 彭绪亚2， 谢 影2

(1．云南农业大学 云南农业大学节能减排检测工程中心， 昆明 650000；2.重庆大学， 重庆 400045)

该研究在中温条件下进行实验室规模的连续式餐厨垃圾厌氧消化试验，用Biolog方法分析了反应器各个运行阶段污泥中微生物群落的多样性。多样性指数分析结果表明：反应器中各个阶段微生物物种丰富度和常见的物种接近，但均一性各阶段有较大的差异。ECO板上碳源的利用情况不同，表明反应器各个阶段微生物群落呈现出不同的微生物多样性。主成分分析结果显示，反应器在启动与稳定运行阶段微生物种群多样性较为接近，而与反应器抑制阶段和恢复阶段微生物种群多样性差异性明显。

餐厨垃圾；微生物多样性；Biolog法；主成分分析；厌氧消化

长期以来由于技术和管理手段的缺乏，我国餐厨垃圾未能得到有效处理，引发了一系列社会民生问题，同时也造成大量生物质资源的浪费。为避免餐厨垃圾带来的公共卫生安全隐患，利用厌氧消化处理餐厨垃圾，并回收其中蕴含的丰富资源，已成为餐厨垃圾资源化的重要途径[1]。厌氧消化是一个复杂的过程包括一系列的微生物将有机物质转化为甲烷。降解过程非常复杂，依赖于多种微生物维持系统平衡。餐厨垃圾厌氧消化处理过程中，厌氧消化反应器内的微生物种群对有机成份的高效转化、反应器的稳定运行都有极为重要的影响。因此，对餐厨垃圾厌氧消化反应器内微生物群落多样性进行研究，对于指导餐厨垃圾厌氧消化反应器的稳定运行具有十分重要的理论意义与工程应用价值。

Biolog最初被用于纯种微生物鉴定, 1991年Garland和Mills首次将该方法应用于土壤微生物多样性的研究[2]。将Biolog用于微生物群落的研究具有很多优点[3]。Biolog微平板技术因其操作标准化分辨力强无需纯培养测定简便等优点，已成为一种简单快速的表征微生物特性的方法，并广泛应用于各种环境微生物群落的研究中[4]。杨永华[5]等对农药污染过的土壤中的微生物群落进行了用Biolog方法测定。研究结果显示，农药污染土壤导致了土壤中的微生物种类的减少，同时土壤中的微生物代谢功能多样性也出现了明显的下降。2002年南非的Jvan Heerden[6]等人对5个城市的污水处理厂活性污泥利用Biolog GN和GP板做了不同稀释倍数下微生物多样性的研究，发现Biolog系统能够用于测定微生物群落的功能多样性和均一性。虽然在表征微生物群落时存在一定的限制，但这种快速的技术仍然是一种区别微生物群落的有效工具。微平板技术主要应用于对土壤方面的微生物多样性以及活性污泥中的微生物多样性进行分析，而使用Biolog技术对厌氧反应器在失衡条件下的微生物群落多样性的研究论文还没有相关的报道。本研究在中温条件下进行实验室规模的连续式单相厌氧消化试验, 采用Biolog技术研究厌氧消化反应器从稳定运行到反应器出现抑制直至反应器恢复的各个阶段，深入研究微生物种群多样性的变化，以期为餐厨垃圾厌氧消化机理研究及厌氧消化反应器的稳定运行提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 厌氧消化系统

实验研究是在一个实验室规模的CSTR (continuously stirred tank reactor )反应器中进行的，该装置没有沼气循环系统。反应器是用PVC材料制作的，有效容积为20 L。消化器内部安装了一个温度感应器。温度被维特在37℃±1℃，通过一个加热夹套与水箱相连接。搅拌电机的搅拌速度被设定为每分钟40转。

1.2 餐厨垃圾

餐厨垃圾来自重庆大学的学生餐馆。餐厨垃圾通过自动破碎机破碎成平均大小为5.0 mm的碎片。试验样品主要性质指标测试结果固体含量(TS)为24.93%，挥发性固体含量(VS)为20.71%，粗脂肪为6.02%。

1.3 反应器污泥

反应器使用的活性污泥是厌氧消化反应器成功启动稳定运行的污泥[14]。

1.4 反应器运行方式

反应器在容积负荷(OLR)为1.0 kgVS·m-3d-1下运行了2个月。容积负荷突然从1.0 kgVS·m-3d-1增加到4.0 kgVS·m-3d-1，这一天被报道为实验的第0 d。反应器在4.0 kgVS·m-3d-1的容积负荷下运行了4 d。

在反应器运行在5～26 d的过程中，OLR逐渐从5.0 kgVS·m-3d-1增加到7.5 kgVS·m-3d-1。实验过程中，反应器运行到OLR分别在第5，8，15，21 d，逐渐增加到5.0，6.0，7.0 和 7.5 kgVS·m-3d-1。当OLR增加到7.5 kgVS·m-3d-1的时候，厌氧消化器产生了一个强烈的抑制。因此，决定减少进料一段时间。因而，反应器在第27～37 d在1.0 kgVS·m-3d-1负荷下运行,在38～45 d在4.0 kgVS·m-3d-1负荷下运行。

1.5 试验物料

试验所用样品为厌氧消化反应器所产生的厌氧消化污泥，分别以第一次冲击负荷试验过程中启动期、稳定期、失衡期以及恢复稳定期共四个具有代表性时期的沼渣作为试验样品，具体描述如下表1。将试验样品用15 mL离心管保存于4℃冰箱中，一周内进行Biolog试验。

表1 试验样品 (kgVS·m-3d-1)

1.6 监测参数与分析方法

试验主要监测指标包括反应器内料液的pH值，气体组分，MLSS，MLVSS等指标。所有的这些指标，采取APHA的标准方法进行测定[7]。厌氧消化所产生的气体由湿式气体流量计测定记录。气体成分及其含量采用气相色谱仪(GC)测定[8]。Biolog-ECO板接种液制备及数据读取接种液的制备参考文献[9]的方法，本研究中，取样品稀释液分别接种于Biolog-ECO 微平板，每孔100 ul将接种于微平板，微平板在28℃下培养，分别于24，28，72，96，120，144，168，192，216和240 h在590 nm和750 nm下测定吸光度值，微生物代谢强度采用平均吸光度(AWCD)来描述[10,15]。

计算公式为:

AWCD=[∑(C-R)]/31

式中，C为反应孔的590 nm吸光度值；R为对照孔750 nm的吸光度值。

对各生物相的平均吸光度值随时间的变化曲线进行分析后采用培养72 h的数据计算微生物群落的多样性指数[13-15]，并应用SPSS18.0软件进行主成分分析。

2 结果与讨论

2.1 试验过程中容积产气率和容积负荷的变化

试验过程中容积产气率和容积负荷的变化见图1，反应器在容积负荷为1.0 kgVS·m-3d-1下，大约运行了2个月的时间。容积负荷突然从1.0 kgVS·m-3d-1增加到4.0 kgVS·m-3d-1，在4.0 kgVS·m-3d-1下运行了4 d。在5～21 d，容积产气率随容积负荷的增加而逐渐增加，反应器运行稳定在第22 d，将7.5 kgVS·m-3d-1容积负荷餐厨垃圾加入到厌氧消化器中，容积产气率从6.42 L·L-1d-1(第22 d)急剧的下降到 3.67 L·L-1d-1(第26 d)。因此可以确定在这个阶段厌氧消化反应器受到了强烈的抑制。为了让反应器从抑制中恢复过来，决定减少进料直到厌氧消化器恢复正常。因而，反应器在第27～37 d在1.0 kgVS·m-3d-1下运行，在38～45 d在4.0 kgVS·m-3d-1下运行，容积产气率随容积负荷的增加而逐渐增加，反应器逐渐从抑制过程中恢复过来。

图1 试验过程中容积产气率和容积负荷的变化

2.2 微生物群落代谢强度的变化

Biolog生态微平板可以快速简单分析微生物群落功能多样性，AWCD用以衡量微生物利用不同碳源的整体能力，从功能代谢水平上揭示微生物群落结构的多样性，是反映微生物活性、描述微生物群落利用碳源功能多样性的一个重要指标。微生物AWCD值随培养时间的变化情况见图2。由图2可以看出，AWCD值在48 h时升高幅度提高，72 h进入指数期，144 h达到稳定期。AWCD值变化趋势不同，表明反应器在不同阶段碳源利用能力与微生物丰度存在差异。实验各样品平均吸光度数值总体大小为：启动期>恢复稳定期>抑制期>稳定期，说明反应器不同时期微生物对碳源的利用能力是存在差异的，抑制期对碳源的利用能力总体上要高于稳定期。AWCD值变化趋势不同，表明反应器在抑制期与稳定期中的微生物丰度存在一定差异。

图2 平均吸光度随时间的变化

2.3 微生物群落功能多样性分析

采用生态学中的3种多样性指数来分析反应器中微生物群落功能的多样性,结果如表2所示。所采用的3种多样性指数反映了微生物群落功能多样性的不同侧面, 其中Shannon指数受群落物种丰富度影响较大, Simpson指数反映了群落中最常见的物种，而McIntosh指数则是度量群落物种均一性的指标。反应器运行在稳定阶段同抑制阶段相比较，Shannon指数差异性较小。Simpson指数与McIntosh指数差异性较大。Simpson指数从稳定期的3.77下降到抑制期的3.25。McIntosh指数从稳定期的14.42上升到15.14。说明反应器从稳定阶段运行到抑制阶段过程中，反应器中微生物群落最为常见的物种与群落物种丰富度有较为明显的差异。

表2 微生物功能多样性

S R Caroline[11]等研究了8个序批式反应器组成的活塞流式厌氧反应器在25℃处理猪粪时细菌群落的变化，结果表明反应器在稳定阶段与抑制阶段，细菌的多样性有明显的差异，这与此次实验的研究结果一致。此次实验通过Biolog微平板技术对厌氧消化反应器从稳定运行到反应器出现抑制的两个阶段进行了深入的研究。通过微生物群落多样性指数对反应器运行在稳定阶段和抑制阶段进行比较分析，Shannon指数差异性较小，Simpson指数和McIntosh指数差异性较大。Simpson指数从稳定期的3.77下降到抑制期的3.25。McIntosh指数从稳定期的14.42上升到15.14。可见，反应器从稳定阶段到抑制阶段群落中最为常见的物种与群落物种丰富度有较为明显的差异，这个研究结论 与S R Caroline[11]等人的研究结论基本一致，并且有具体的群落多样性指数数值，可以更加形象具体的描述微生物群落多样性，相比S R Caroline等人的研究成果更加详细、具体。

2.4 微生物不同种类碳源利用与微生物种群多样性的主成分分析

采用培养72 h的数据对ECO板上碳源的利用情况进行分析, 试验显示第4 d的样品对L-天冬酰胺酸,丙酮酸甲脂,4-羟基苯甲酸，L-丝氨酸，吐温80，葡萄糖-1-磷酸盐，甘氨酰-L-谷氨酸利用较快且充分；第15 d的样品对葡萄糖-1-磷酸盐，D-纤维二糖，甘氨酰-L-谷氨酸，L-a-甘油，D-葡萄胺酸，L-精氨酸较容易利用；第26 d的样品对D-葡萄胺酸，4-羟基苯甲酸、L-丝氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、衣康酸、葡萄糖-1-磷酸盐利用较完全；第35 d的样品利用吐温80，4-羟基苯甲酸，吐温40，腐胺，β-甲基D-葡萄糖苷，D-半乳糖内酯较充分。反应器各个阶段的微生物对ECO板上碳源的利用情况不同，说明反应器在各个阶段的活性污泥呈现出不同的微生物多样性。

C Delbes[12]等人采用单链构象多态性检测分析16SrRNA的扩增产物，分别研究了乙酸累积导致系统失衡前后细菌菌群的变化，其结果表明一种螺旋菌(Clostridium.spp)和联合菌属(Synergiste.spp)菌群表现出较高活性， Clostridium sp的数量在反应器失衡后明显增加。C Delbes等人通过PCR-SSCP技术，认为反应器在失衡前后细菌菌群多样性出现了明显的变化。在厌氧反应器中的微生物种类非常多，C Delbes[12]等人通过PCR-SSCP技术，在反应期失衡前后分离出Clostridium.sp和Synergistes.spp，认为两种细菌在反应器失衡之后数量明显增加。这个研究结果有较大的局限性，毕竟在反应器失衡前后绝大部分微生物是不能够鉴定出来的，鉴定出来的这2种细菌并没有太大的代表性。在本研究过程中，通过Biolog技术可以直接对反应器抑制前后，厌氧消化反应器从稳定运行到反应器出现抑制的2个阶段进行深入研究，通过对微生物不同种类碳源利用进行比较分析。通过数据对比可以发现，稳定期系统中微生物对碳源利用能力碳水化合物和氨基酸类碳源利用能力较强，而其它碳源相对利用较少，微生物对碳源利用能力最强的10种碳源中6种属于碳水化合物，4种属于氨基酸类；而抑制期对碳水化合物、氨基酸类、羧酸类和多聚物类多种碳源均表现出较高的利用能力，微生物对碳源利用能力最强的10种碳源中，3种属于碳水化合物，3种属于氨基酸类，2种属于羧酸类，2种属于多聚物类。说明厌氧消化系统在抑制期内吸收碳水化合物和氨基酸类的微生物丰度有明显降低，吸收羧酸类和多聚物类的微生物丰度有明显增高。

采用培养72 h的微生物碳源利用率的数据，使用SPASS软件做出反应器中微生物种群多样性的主成分分析图。各样本在空间上位置的不同是和微生物利用碳底物的利用能力相关联的。具体而言，各样本在PC空间不同PC轴坐标的差异是与对聚集在该PC轴上碳源的利用能力相联系的，主成分分析可以将不同样本的多元向量变换为互不相关的主元向量，在降维后的主元向量空间中用点的位置直观地反映出来。通过对31种单一碳源的主成分分析可知，决定主成分1(CP1)的碳源为L-丝氨酸，D-葡萄胺酸，甘氨酰-L-谷氨酸等12种碳源；决定主成分2(CP2)的碳源为a-丁酮酸，衣康酸，I-赤藻糖醇等8种碳源。如图3所示。第1主成分特征值的贡献率为54.92%，远大于第2主成分特征值的贡献率24.32%。因而能很好地区分各反应器各阶段微生物的多样性。从图中还可以看出，第4 d与第15 d主成分分析差异性较小，而与反应器其它运行阶段主成分差异性明显，表明反应器在启动与稳定运行阶段微生物种群多样性较为接近，而与反应器抑制阶段和恢复阶段微生物种群多样性差异明显。从图中还可以看出，第15 d的样品与第26 d的样品主成分差异性明显，表明反应器在稳定运行阶段和抑制阶段，微生物种群多样性出现了明显差异。从图中也可以看出，第26 d的样品与第35 d的样品主成分差异性明显，表明反应器在抑制阶段与恢复性阶段，微生物种群多样性差异明显。

图3 72小时的主成分因子荷载图

国内外关于对厌氧反应器在失衡条件下的微生物群落多样性的研究论文较少。目前从已经报道的研究资料来看，使用分子生物学16SRNA的技术比较多，而使用Biolog的技术还没有相关的报道。采用分子生物学16SRNA技术是对样品中优势微生物DNA进行分析，而采用Biolog微平板技术是通过样品对不同碳源的吸收能力进行数据采集，然后依靠计算公式和分析软件进行相关分析。由于同种微生物(16SRNA相同)在不同的生态环境中，代谢途径有可能有较大的差异。因此，使用Biolog微平板技术对微生物群落多样性进行研究具有误差小，精度高等优势。

国内学者采用PCR-TGGE技术对餐厨垃圾单相厌氧反应器中的细菌群落结构分的研究结果表明，反应器内微生物群落结构一直处于动态变化过程中，各阶段间微生物群落结构存在明显的阶段性演替，本实验通过72 h的主成分因子荷载图可以看出，反应器从稳定运行到反应器出现抑制，微生物种群多样性差异明显[13]。这个实验结论与彭绪亚的前期实验结果一致。然而，彭绪亚采用的PCR-TGGE通过16SRNA技术对样品中优势的微生物DNA进行分析，只是得到了厌氧反应器中稳定运行与抑制阶段微生物群落结构演替这个结论，而72 h的主成分因子荷载图则可以直观的显示反应器在稳定运行阶段与抑制阶段的微生物多样性的差异大小，更加形象的描述出微生物群落多样性的差异。

3 结论

(1)抑制期与稳定期的AWCD值变化趋势不同，表明反应器在抑制期与稳定期相比较微生物丰度存在差异；抑制期与稳定期吸光度值总体抑制期大于稳定期，说明反应器在抑制期和稳定期对碳源的利用能力是存在差异的，抑制期对碳源的利用能力总体上要高于稳定期。

(2)稳定期同抑制阶段相比较，Simpson指数与McIntosh指数差异性较大，Simpson指数从稳定期的3.77下降到抑制期的3.25，McIntosh指数从稳定期的14.42上升到15.14，说明反应器从稳定阶段到抑制阶段，微生物群落中最为常见的物种与群落物种的丰富度有较为明显的差异。

(3) 通过微生生物种群多样性主成分分析，第15 d的样品与第26 d的样品主成分差异性明显。表明反应器在稳定运行阶段和抑制阶段，微生物种群多样性差异明显。

(4)通过72 h的主成分因子荷载图可以形象的看出反应器在稳定运行阶段和抑制阶段，微生物种群多样性出现了明显差异；抑制阶段与恢复性阶段相比，微生物种群多样性差异明显。通过对微生物不同种类碳源利用的比较分析，说明当厌氧消化系统出现抑制的时候，微生多样性出现了明显变化。一方面以芽孢杆菌属和假单胞菌属等以吸收碳水化合物和氨基酸类等简单化合物的微生物的丰度明显减少；另一方面以吸收羧酸类和多聚物类复杂化合物的微生物的丰度明显增高。

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Microbial Diversity Analysis for Anaerobic Digestion of Kitchen Waste by Biolog Method

Mei Bing1, PENG Xu-ya2, XIE Ying2

(1.Yunnan Agricultural University，kunming 650000，China；2.Chongqing University , chongqing 40045，China )

Lab-scale continuous anaerobic digestion of kitchen waste at mesophilic temperature was carried out in this study. Biolog method was used to analyze the microbial diversity of sludge during each stage in the reactor. According to the diversity index analysis, the microbial species of every stage in the reactor had a resemblance in richness to the most common species, but the evenness was quite different. The differences in carbon source utilization on ECO plate indicated the differences in microbial structures, species and quantity in each stage, which presented the diversity of microbial communities. According to the principal component analysis, the microbial communities in the reactor was similar during the starting and stable periods, but the microbial communities were quite different during the inhibition and recovery period.

food waste; microbial diversity; biolog method ;principal component analysis ; anaerobic digestion

2015-03-30

项目来源： 云南农业大学博士科研启动基金；云南农业大学校企合作项目(KX141111)

梅 冰(1982-),男，博士，主要从事固体废物处理与处置方面的研究工作，E-mail：meibing11meibing@163.com

S216.4; X705

A

1000-1166(2016)01-0014-05