82种中草药对罗非鱼无乳链球菌的抑菌活性研究

梁志凌，马艳平，马江耀，郝 乐，刘振兴，柯 浩

（ 广东省农科院动物卫生研究所/ 广东省兽医公共卫生公共实验室/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东 广州 510640）

82种中草药对罗非鱼无乳链球菌的抑菌活性研究

梁志凌，马艳平，马江耀，郝 乐，刘振兴，柯 浩

（ 广东省农科院动物卫生研究所/ 广东省兽医公共卫生公共实验室/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东 广州 510640）

采用琼脂扩散法的牛津杯法，测定82种中草药水提物对罗非鱼（Tilapia sp.）无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的体外抑菌活性，并采用纸片法选择几种活性较强的中草药水提物对无乳链球菌进行联合药敏试验。结果显示，黄连、五倍子、红藤、大蒜、北五味子、夏枯草、艾叶、苏木、三棵针、紫苏、土槿皮、老鹤草、石榴皮、大黄、丹参、鱼腥草、虎杖、赤芍、车前草、田基黄20种中草药水提物对无乳链球菌表现出明显的体外抑菌活性，其中黄连、五倍子的体外抑菌效果最显著；中草药联合药敏试验结果表明，五倍子与大黄、艾叶、丹参、苏木、北五味子、红藤、石榴皮、虎杖、黄连表现为协同作用；黄连与大黄、丹参、苏木、红藤表现为协同作用，与艾叶、北五味子、石榴皮表现为拮抗作用；三棵针与大黄、丹参、苏木、红藤、石榴皮、黄连、夏枯草、五倍子表现为协同作用，与艾叶、北五味子、虎杖表现为拮抗作用。

中草药；罗非鱼；无乳链球菌；联合药敏试验；抑菌活性

罗非鱼是联合国粮农组织推荐的养殖品种，被世界各地广泛引种与养殖［1］。我国的环境和气候条件适合罗非鱼生产，这些有利条件使我国成为罗非鱼养殖的主要国家之一［2］，罗非鱼养殖已成为我国南方地区的支柱性产业［3］，我国也成为世界上最大的罗非鱼生产国和出口国。近年来随着罗非鱼的养殖密度增大、养殖环境恶化，病害频发成为制约我国罗非鱼产业发展的主要因素，其中无乳链球菌引起的细菌性疾病近年有加剧趋势，已成为罗非鱼的重要病原，对罗非鱼养殖造成重大损失［3］。链球菌可利用宿主巨噬细胞逃避抗生素类药物对其杀害［4］，长期使用抗生素药物导致现有罗非鱼源病原菌分离株对许多允许使用的抗生素耐药性增强，导致利用抗生素防治链球菌病的效果不太理想，造成罗非鱼细菌病的治疗困难，此外考虑到食品安全及环境保护问题，临床上迫切需要寻找绿色安全有效的抗生素替代品以减少抗生素使用，最终实现有效防治罗非鱼细菌病的目标。中草药是纯天然的药物，具有多功能多靶点作用、不易引起病菌耐药性以及无药物残留等优点，目前在水产养殖动物病害防控的应用中越来越受到重视。本研究分析了黄连、五倍子、红藤等82种中草药水提物对罗非鱼无乳链球菌的体外抑菌作用，以期为链球菌病害的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄连、五倍子、红藤等82种中草药由广州市万怡大药房提供。

无乳链球菌为广东省农科院动物卫生研究所从广东省广州市增城市某罗非鱼养殖场患病罗非鱼中分离、鉴定并保存。

THB培养基：酵母浸出物3 g/L，胰蛋白胨20 g/L，牛肉浸膏5 g/L，葡萄糖2 g/L，Na2CO32.5 g/L，NaCl 2 g/L，Na2HPO40.4 g/L，琼脂粉15 g/L，pH7.2～7.4。THB液体培养基：THB培养基不加琼脂粉。

1.2 试验方法

1.2.1 中草药水提液的制备 称取中草药50 g，加纯水约500 mL浸泡1 h后置于加热板上温火煮沸1 h，12层纱布过滤；如上反复煎煮3次，收集滤液。滤液用滤纸过滤后浓缩成含生药1 g/mL的提取液，于121℃灭菌 15 min，置于4℃冰箱中保存备用。大蒜提取液制备［5］：取市售大蒜去皮捣碎，加入适量蒸馏水，挤压过滤，制成含生蒜1 g/mL的大蒜提取液。

1.2.2 病原菌菌悬液的制备 将无乳链球菌菌株在THB培养基上划线培养24 h，用THB液体培养基冲洗，在28℃条件下摇床振荡培养20 h，稀释为5×107cfu/mL的菌悬液，备用。

1.2.3 抑菌活性的测定 采用琼脂扩散法的牛津杯法［6］，取直径90 mm，高16～17 mm的玻璃培养皿，注入加热融化的THB培养基20 mL，使其在碟底均匀摊布，置于水平台面上使其凝固，制成THB培养基平板备用。吸取0.1 mL菌悬液，置于THB培养基并涂布均匀。在每个平板以等距离均匀放置牛津杯3个。吸取中药药液0.3 mL注入牛津杯内，将加满药液的平板置于28℃生化培养箱中培养24 h，观察并测量抑菌圈直径大小，每种药液在不同平板上重复3次，取其平均值；另以无菌水作为空白对照。以抑菌圈直径表示抑菌活性，抑菌圈直径≥15 mm表示抑菌活性较强，＜15 mm表示抑菌活性较弱。

1.2.4 中草药水提物联合药敏试验［7］于培养皿内加入预热融化的THB培养基，均匀摊布，置于水平台面上使其凝固，制成THB培养基平板备用。吸取0.1 mL菌悬液，置于THB平板培养基并涂布均匀。将两种含中药纸片贴于平板上，两片之间相距以2～3 mm为宜，置于28℃孵育过夜，取出观察结果。根据呈现的抑菌图形，结果判定“协同”、“相加”、“无关”或者“拮抗”作用。本次分别以五倍子、黄连、三棵针为主药，测定主药与其他中药对无乳链球菌的联合药敏。

2 结果与分析

2.1 中草药水提物的体外抑菌活性

82种中草药水提物对无乳链球菌的体外抑菌活性测定结果见表1。从表1可见，黄连、五倍子、大蒜、北五味子、夏枯草、艾叶、苏木、三棵针、紫苏、土槿皮、石榴皮、老鹤草、鱼腥草、虎杖、赤芍和车前草等16种中草药水提物对无乳链球菌的抑菌圈达到15 mm以上，有较强的体外抑菌活性，其抑菌活性由强至弱顺序为黄连＞五倍子＞大蒜＞北五味子＞夏枯草、艾叶＞苏木＞三棵针、紫苏、土槿皮＞石榴皮、老鹤草＞鱼腥草＞虎杖、赤芍、车前草，其中黄连、五倍子的体外抑菌效果尤为显著，抑菌圈达到35 mm以上；田基黄、香薷、桑寄生、马齿苋、厚朴、山豆根和败酱草等7种中草药水提物对无乳链球菌产生抑菌圈，但抑菌圈直径小于15 mm，呈微弱的抑菌活性；其余中草药水提物对无乳链球菌没有呈现抑菌圈，无抑菌活性。

2.2 中草药水提物联合药敏试验结果

采用琼脂扩散纸片法选择几种活性较强的中草药水提物对无乳链球菌进行联合药敏试验。根据呈现的抑菌图形，琼脂扩散纸片法一般出现协同作用、相加作用、无关作用和拮抗作用4种结果。协同作用有3种情况：（1）甲、乙两药均有抑菌活性，两者又能联合增效，抑菌圈交界角平直；（2）甲药无抑菌活性，乙药的抑菌圈向甲药扩大；（3）甲、乙两药均无抑菌活性，但两药之间出现抑菌区域。本试验为第1种情况。相加作用甲、乙两药的抑菌圈相连，交界角呈现钝圆形。无关作用也有3种情况：（1）甲、乙两药均无抑菌活性，无抑菌圈；（2）甲药无抑菌活性，乙药有抑菌活性，图形表现为甲药无抑菌圈，乙药呈现完整抑菌圈；（3）甲、乙两药均有抑菌活性，两药抑菌圈交角处呈尖锐形状。本试验为第3种情况。拮抗作用有2种情况：（1）甲药无抑菌活性，乙药有抑菌活性，甲药对乙药抑菌圈呈切割形状；（2）甲、乙两药均有抑菌活性，两药抑菌圈向相反方向偏移。本试验为第2种情况。

试验结果（表2）显示，五倍子与大黄、艾叶、丹参、苏木、北五味子、红藤、石榴皮、黄连、虎杖表现为协同作用；黄连与大黄、红藤、苏木、丹参表现为协同作用，与石榴皮、艾叶、北五味子表现为拮抗作用；三棵针与大黄、丹参、苏木、红藤、石榴皮、黄连、夏枯草、五倍子表现为协同作用，与艾叶、北五味子、虎杖表现为拮抗作用。

3 结论与讨论

由于中药药液的抑菌活性较弱，纸片吸载的中药量过少，抑菌圈往往太小，难以达到测量要求，因此一般较少采用纸片法。本试验选用牛津杯琼脂扩散法进行试验，牛津杯内加满药液可以保证充分渗透，试验结果抑菌圈相对大些。此外，某些中草药水提液含有胶质，造成不同的药液粘度不同，导致加入牛津杯里的药液在琼脂培养基上的扩散速度有差异，在一定程度上影响抑菌圈的大小。本试验供试药液均采用中药传统的煎煮法提取，这一方法适用于有效成分能溶于水，且对湿、热均稳定的药材。这一方法提取的成分比较复杂，除有效成分外，提取液往往含杂质较多，且有少量脂溶性物质溶出；另外某些不溶于水的成分含量低，高温煎煮也致使挥发性物质丢失，因此可能导致药液中有效成分损失较多、有效成分提取不完全等问题［8］，对中药的抑菌试验结果有一定影响。

本研究对82种中草药的抗无乳链球菌活性进行筛选，结果发现部分中草药对罗非鱼无乳链球菌具有明显的体外抑制活性，其中黄连、五倍子表现出很强的抑制活性。黄连的抗菌成分主要是黄连碱，五倍子含有大量鞣质，可以与生物体的蛋白质、核酸、多糖及生物碱结合产生沉淀作用，影响细菌的营养和代谢，从而表现出显著的抗菌作用［9］。大蒜中的大蒜素能与巯基酶竞争性结合，抑制菌体代谢酶的活性，通过脂质过氧化等作用损伤菌体的膜系统，影响菌体生长的大环境［10］。北五味子的主要有效成分为木脂素类化合物，具有抗菌、抗氧化等功效［11］。夏枯草水提物含有丰富的三萜类、甾体类、黄酮类等化学成分，有一定的抑菌作用［12］。三棵针主要通过喹啉类生物碱如黄连素发挥抗菌作用［13］。石榴皮含有石榴皮多酚，是发挥抗菌作用的主要成分［14］。鱼腥草多种成分亦具有抗菌作用，本研究结果与文献相符［15］。其他中草药的有效成分和作用机制有待进一步探讨。

表1 82种中草药水提物对罗非鱼无乳链球菌的抑菌活性

（续表1）

表2 中草药水提物对罗非鱼无乳链球菌的联合药敏试验结果

考虑到组方的需要，本研究选取五倍子、黄连、三棵针、大黄、艾叶、丹参、苏木、北五味子、红藤、石榴皮、虎杖和夏枯草等12种中草药进行联合药敏试验，结果表明，五倍子与大黄、艾叶、丹参、苏木、北五味子、红藤、石榴皮、黄连、虎杖均表现为协同作用。三棵针与大黄、丹参、苏木、红藤、石榴皮、黄连、夏枯草、五倍子也表现为协同作用，作为复方中药制剂组方的基础，这为渔药开发绿色安全有效抗生素替代品提供了一定的参考。

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（责任编辑 崔建勋）

Antimicrobial activities of 82 kinds of Chinese herbal medicines against the pathogen of Streptococcus from tilapia in vitro

LIANG Zhi-ling，MA Yan-ping，MA Jiang-yao，HAO Le，LIU Zhen-xing，KE hao
（ Animal Health Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/ Guangdong Open Laboratory of Veterinary Public Health/Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention，Guangzhou 510640，China）

The antimicrobial activities of 82 Chinese herb aqueous extracts against the pathogen of Streptococcus from tilapia in vitro were screened by the agar Oxford plate diffusion system. Results demonstrated that 20 kinds of Chinese herbs could effectively inhibit the growth of S. agalactiae，Coptis chinensis and Galla chinensis had the best inhibitory effects. In the combined susceptibility test，disc agar diffusion was used to evaluate the combination effects of 12 Chinese herb aqueous extracts in vitro against the pathogen of Streptococcus from tilapia. The results showed that there was synergic effect for the combined inhibition of aqueous extracts from Galla chinensis and Rheum palmatum L. or Artemisia argyi Levl. et Vant. or Salvia miltiorrhiza or Caesalpinia sappan or Schisandra chinensis or Sargentodoxa cuneata or Punica granatum L. or Reynoutria japonica Houtt or Coptis chinensis ；synergic effect for Coptis chinensis and Rheum palmatum L. or Salvia miltiorrhiza or Caesalpinia sappan or Sargentodoxa cuneata；synergic effect for Berberis spp. and Rheum palmatum L. or Salvia miltiorrhiza or Caesalpinia sappan or Sargentodoxa cuneata or Punica

Chinese herbal medicine；Tilapia sp.；Streptococcus agalactiae；combined susceptibility test；antimicrobial activities

S948

A

1004-874X（2016）10-0128-06

2016-06-20

广东省鱼病防治专项（2014010701）；广东省海洋渔业科技推广专项（A201601B04）

梁志凌（1970-），女，兽医师，E-mail：snailt@126.com

柯浩（1965-），男，硕士，研究员，E-mail：keha@tom.com

梁志凌 ，马艳平，马江耀，等. 82种中草药对罗非鱼无乳链球菌的抑菌活性研究［J］.广东农业科学，2016，43（10）：128-133.

granatum L. or Coptis chinensis or Prunella vulgaris Linn or Schisandra chinensis. But the effect of combination of aqueous extracts was inhibitory interaction between Coptis chinensis and Artemisia argyi Levl. et Vant. or Schisandra chinensis or Punica granatum L.，inhibitory interaction between Berberis spp. and Artemisia argyi Levl. et Vant. or Schisandra chinensis or Reynoutria japonica Houtt. Combination of Galla chinensis and Prunella vulgaris Linn or Berberis spp.，Coptis chinensis and Reynoutria japonica Houtt or Prunella vulgaris Linn or Galla chinensis or Berberis spp. showed indifferent interactions.