申克孢子丝菌基因分型的研究现状与展望

赵莉佩 崔岩 李珊山

(吉林大学第一医院皮肤性病科，长春 130021)



·综述·

申克孢子丝菌基因分型的研究现状与展望

赵莉佩 崔岩 李珊山

(吉林大学第一医院皮肤性病科，长春 130021)

申克孢子丝菌以往被认为单一菌种，呈全球性分布。然而不同区域来源的菌株，在药物敏感性、致病力等方面差异较大。RAPD、RFLP等多种分子生物学技术曾被用于该菌基因分型的探讨。近年来，以CAL基因结合菌株表型的分类方法，已成为申克孢子丝菌复合体公认的划分方法。本文将对申克孢子丝菌的基因分型方法进行综述，并着重阐述CAL基因分型的研究进展。

申克孢子丝菌；孢子丝菌病；基因分型；钙调蛋白基因

[Chin J Mycol，2016，11(5):316-320]

1 概 述

孢子丝菌病 (sporotrichosis)是一种亚急性或慢性皮下组织真菌病，其致病菌为双相型申克孢子丝菌 (Sporothrixschenckiisensulato)。该菌是一种腐生真菌，在自然界广泛存在，并分布于世界各地，尤其以热带和亚热带多见，主要流行地区包括拉丁美洲、南非、印度、日本等地[1]，在我国各个省市均有报道[2]。

研究者发现不同地区的孢子丝菌病的临床表现、菌株的致病力和药物敏感性存在差异。流行病学显示，孢子丝菌病在中国主要以固定型为主[3-7]，而巴西、秘鲁、委内瑞拉等拉美国家以淋巴管型为主[2,8-10]。药敏结果显示，来自委内瑞拉的菌株对特比萘芬的MIC值最低，乌拉圭的菌株对伊曲康唑的MIC值最高[11]，而来源于中国[12]或印度[13]的菌株对伊曲康唑或伏立康唑的MIC值普遍低于巴西[14]的菌株。另外，不同地区菌株基因多态性与临床分型的关系存有争议[15-16]。可见，不同地区来源的菌株存在着显著的差异，研究者甚至推测这些菌株可能不是单一种。因此，研究者一直试图利用多种分子标记的方法对申克孢子菌进行基因多态性的研究，以期解答上述问题。本文将对申克孢子丝菌的基因分型研究加以综述。

2 限制性片段长度多态性分析 (RFLP)

线粒体DNA (mtDNA)具有母系遗传、拷贝数多、突变率高、极少发生重组等特性，在菌种鉴定和基因分型中具有重要的研究意义。日本学者Ishizaki及其课题组多年致力于通过限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法分析申克孢子丝菌mtDNA多态性。该课题组将分别来自墨西哥、危地马拉、哥斯达黎加、美国、巴西、印度、日本和中国等地申克孢子丝菌临床分离株的mtDNA进行RFLP分析，发现片段产物可分为31个型别[17-18]，根据系统进化树可将其分型分为2群：A群以南非、北美、中美和南美的菌株为主，B群以东亚、东南亚和大洋洲菌株为主。但近年来根据CAL基因结合表型特征将申克孢子丝菌重新划分为6个种[19]，并发现每个种群地理分布有所不同[20]，其中常见致病菌球形孢子丝菌呈全球性分布，申克孢子丝菌 (S.schenckiisensustricto)主要分布于美国、阿根廷、巴西、秘鲁等美洲国家，巴西孢子丝菌主要分布于巴西地区。上述申克孢子丝菌mtDNA的种系发生与地理关系密切，但申克孢子丝菌的重新划分说明申克孢子丝菌不同菌种的存在，不同地区有其优势菌种，因此申克孢子丝菌mtDNA多态性仍需进一步探讨。

3 随机扩增DNA多态性 (RAPD)

随机扩增DNA多态性 (random amplified polymorphic DNA，RAPD)是指利用随机引物对基因组DNA进行扩增，基因组中碱基的缺失、重排、插入或突变，会形成图谱条带的多态性。国内学者廉翠红、李丽莉、涂正可等分别[21-23]应用RAPD对来自不同地区、临床型别各异的申克孢子丝菌株进行DNA多态性分析，发现菌株基因组的带型与地区来源相关，而Reis等[24]应用RAPD分析Rio de Janeiro的45株菌株，其中25株来源于当地的猫，另外包括1株来源于美国的菌株，发现当地的菌株与来源于美国的菌株存在明显差异，但本地菌株的基因分型与地理区域并无相关性；另外，Kong等[15]利用RAPD的方法对15株来源于中国地区的固定型和淋巴管型临床株进行基因分型，认为不同临床型别的分离株分型与临床分型相关，而Mesa-Arango对来自加勒比海地区的44株申克孢子丝菌，利用同样方法分析，认为临床分型与菌株的基因型无关[16]。

目前研究表明中国地区以球形孢子丝菌为主，而球形孢子丝菌呈全球性分布其进化与地域分布无明显相关性，而上述研究表明应用RAPD分析基因分型与地域来源或临床型别的相关性，仍存有争议，并且需要利用多个引物共同分析，可能更适于区域内的菌株分型，因此作者认为我国病原菌株需进一步分类与鉴定。

4 扩增片段长度多态性 (AFLP)

AFLP是在RFLP基础上，结合特异性引物扩增，而建立的一种分子标记技术。Neyra等[25]应用扩增片段长度多态性 (amplified fragment length polymorphism，AFLP)对来自秘鲁、墨西哥等国家的43株申克孢子丝菌进行了多态性的分析，结果发现来自秘鲁的32株菌株可分为两群，其中A群23株，B群9株，但秘鲁的菌株基因分型与其地理来源与临床型别无关；非美洲国家的菌株仅南非的菌株与秘鲁的菌株基因分型接近。该实验由于菌株地理来源有限，实验结果并未完全阐明不同国家间菌株的亲缘关系。虽然AFLP具有重复性强、信息量大、多态性高等优点，但该方法操作繁琐、技术和设备要求较高，因此AFLP在申克孢子丝菌分型方面的研究相关报道较少。

5 rDNA序列分析

ITS区 (Internal Transcribed Spacer)序列具有适合的保守性和可变性，使其作为进行真菌种间分类及种内分型最可靠方法之一。de Beer[26]等人利用ITS序列对申克孢子丝菌和其有性世代Ophiostomastenoceras进行分析，发现应用该方法可以区分申克孢子丝菌的临床株和环境株，并且作者从系统进化树中推测申克孢子丝菌可能分为不同的种。Galhardo等[14]利用ITS序列构建的系统树显示，尽管来自西班牙和巴西的菌株相似度约为90%，但两者的菌株明确分为两个群。

虽然利用ITS区序列进行基因分型可靠性和分辨率均较好，但是测序所需时间较长，操作繁琐，并不适用于临床的分型研究工作。研究者为了解决上述问题，将ITS与RFLP结合，进行了探讨。Watanabe等[27]将204株菌株应用RFLP对ITS序列进行分析，PCR产物结果显示，ITS-RFLP可分为4个rDNA类型 (Ⅰ-Ⅳ)，该结果支持了Ishizaki等人的分型结果，其中Ⅰ-Ⅲ型与A群一致，Ⅳ型与B群一致,Ⅰ型主要见于非洲、美洲，Ⅱ型主要见于南美，Ⅲ型主要见于北美，Ⅳ型主要见于澳洲和亚洲。Zhang等[28]利用RFLP对基因进化速率更快的非转录间隔区 (Nontranscribed Intergenic Spacer，NTS)进行分析，结果表明来自中国的31株临床株的NTS区可以分为15种带型，并认为NTS区的多态性与菌株来源或临床型别相关。

6 钙调蛋白基因序列分析 (CAL)

尽管各国相关学者一致认为不同地区来源申克孢子丝菌的存在显著差异，甚至申克孢子丝菌可能为几个隐种 (cryptic species)的复合体[26,29]，但始终无法将基因型别与菌株表型相结合，区分申克孢子丝菌复合体不同种之间的差异。

2006年，Marimon等[30]通过对不同地理来源的60株菌株进行多基因位点 (几丁质酶、β-tubulin、钙调蛋白)序列分析，结果表明申克孢子丝菌至少存在6个地理分布不同的基因亚型，并发现钙调蛋白基因位点提供的信息量最大。CAL基因大小约685个bp，其中不变位点474个，信息位点180个，非信息性位点34个。为进一步证实上述结果，Marimon等[31]对127株申克孢子丝菌进行表型特征和基因型的比较，发现CAL基因对区分申克孢子丝菌复合体种间差异具有一定特异性，且形态学、生理学等表型特征与CAL序列分析结果一致。最终，Marimon等[19]将申克孢子丝菌 (Sporothrixschenckiisensulato)确定为6个种的复合体 (complex)，包括狭义申克孢子丝菌 (S.schenckiisensustricto)、球形孢子丝菌 (S.globosa)、巴西孢子丝菌 (S.brasiliensis)、卢艾里孢子丝菌 (S.luriei,formly namedS.var.luriei)、墨西哥孢子丝菌 (S.mexicana)和苍白球孢子丝菌 (S.pallida,synonymyS.albicans)(见图1)，其中，球形孢子丝菌、巴西孢子丝菌和墨西哥孢子丝菌为新鉴定的菌种。球形孢子丝菌、申克孢子丝菌 (S.schenckiis.str)和巴西孢子丝菌为常见致病菌；卢艾里孢子丝菌非常少见，仅有1例已证实来自南非[32]及2例未证实来自意大利[33-34]的感染病例；近年在南非、葡萄牙等地发现墨西哥孢子丝菌[35-37]与苍白球孢子丝菌[38]的数例感染人类病例，多见于免疫抑制患者。

Marimon提出的分类法得到了多种分型方法的验证。Zhang[20]等应用AFLP将来自世界各地的122株病原株分为13个group，尽管球形孢子丝菌地理来源广泛，但均在一个group中；来自巴西的巴西孢子丝菌由3个group组成，各群区分与地理区域并无相关性；狭义申克孢子丝菌由5个group组成，与多位点序列分析 (CAL，TEF1，TEF3)分型一致，地理来源差异很小。Zhou等[39]利用ITS和β-tubulin通过构建系统树也可将申克孢子丝菌复合体区分开。

图1 申克孢子丝菌复合体表型鉴别要点[1]

Fig.1 Identification keys forSporothrixspecies of clinical interest,based on morphological and phenotypic tests

Rodrigues课题组分别发现滚环扩增 (Rolling Circle Amplification，RCA)、特异性扩增和限制性酶切[40-42]可以将不同菌种的CAL基因明确区分不同的带型；Oliveira[43]等发现应用非特异引物T3B对gDNA进行扩增后，可以区分4种菌株，该课题组进一步利用MALDI-TOF-MS[44]分析申克孢子丝菌复合体，发现各菌体代谢产物质谱具有种特异性；Sasaki等[45]利用脉冲电场凝胶电泳 (pulsed field gel electrophoresis，PFGE)的方法，发现申克孢子丝菌复合体染色体的带型和大小存在多态性，虽然该方法难以区分菌种，但作者认为通过带型可以推测菌株的致病力强弱。

7 展 望

新分类法的提出，表明不同地域有其相应申克孢子丝菌复合体的优势菌种。动物实验结果显示，不同菌种的致病力存在一定的差异：巴西孢子丝菌与狭义申克孢子丝菌毒力最强，接种后小鼠的致死率及感染的播散能力均高于其他种，之后依次是球形孢子丝菌、墨西哥孢子丝菌，苍白球孢子丝菌毒力最弱，这与各地区临床表现基本一致[46]。最近研究表明，致病力差异的重要原因可能由菌种的表面抗原差异造成[47]。来自多地的药敏试验报告表明[48-50]，巴西孢子丝菌、狭义申克孢子丝菌和球形孢子丝菌均对特比萘芬最为敏感(MIC GM 0.06-0.23 μg/ml)，但对伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B等药物的MIC值差异较大，这是由实验标准 (培养温度、孢子浓度)不同造成的。因此，药敏试验需多中心采用统一标准，相互协助开展。

我国目前已知的申克孢子丝菌主要以球形孢子丝菌为主[51-52]，近年曾在江西地区发现狭义申克孢子丝菌[53]，而其他地区未见报道，相关研究需加以验证。以CAL基因构建的系统进化树中，我国球形孢子丝菌同处于一个群，但可分为2个亚群，这两个亚群的菌株和地理分布是否相关尚不清楚。

综上，申克孢子丝菌的重新划分开启了孢子丝菌研究的新领域。在新的分类法指导下，可以将CAL基因测序结合AFLP、mtDNA-RFLP、RAPD、T3B fingerprint等分子标记技术，深入探讨种内基因分型与临床类型、地域来源、药物敏感性、菌株毒力相关性，以期为孢子丝菌病的临床诊断与治疗提供依据。

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[本文编辑] 王 飞

Research status and prospect of genotyping ofSporothrixschenckiisensulato

ZHAO Li-pei，CUI Yan，LI Shan-shan

(DepartmentofDermatologyandVenereology，FirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China)

Sporothrixschenckiisensulato,previously considered to be a single species,has a worldwide distribution.Nevertheless,strains from different geographical regions differ greatly in their pathogenicity and susceptibility to different drugs.A wide variety of molecular techniques such as random amplified polymorphic DNA (RAPD),restriction fragment length polymorphism (RFLP) have been investigated for genotyping of the fungi.In recent years,classification methods based on calmodulin (CAL) gene and phenotypic features have been accepted to distinguish isolates in theSporothrixschenckiicomplex.The genotyping methods ofSporothrixschenckiis.l.have been summarized in this article and focus on the research progress of CAL gene.

Sporothrixschenckii;sporotrichosis;genotype;calmodulin gene

国家自然科学基金 (81573060)；吉林省科技厅科技创新人才培育计划 (20150520039JH)

赵莉佩，女 (汉族)，博士研究生在读.E-mail:zhaolp810@163.com

李珊山,E-mail:shansalee@163.com

R 379.9

A

1673-3827(2016)11-0316-05

2016-06-16