右美托咪定预处理对2型糖尿病大鼠缺血再灌注脑损伤的作用

王 鹏，单世民，郝 伟，任立洁

右美托咪定预处理对2型糖尿病大鼠缺血再灌注脑损伤的作用

王 鹏，单世民，郝 伟，任立洁

目的:探讨右美托咪定预处理对2型糖尿病大鼠缺血再灌注脑损伤的影响及机制。方法：雄性SD大鼠60只建立2型糖尿病大鼠模型，随机分为假手术组(S组)、缺血再灌注组（I/R组）、右美托咪定组（D组），建立全脑缺血再灌注损伤模型。缺血前30 min D组静脉输注右美托咪定0.05 μg·kg-1·min-1，S组和I/R组静脉输注0.9%生理盐水2 mL/h，持续输注120 min。于缺血再灌注24 h对各组进行神经功能缺损评分（NDS评分），检测脑组织含水量，脑组织丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶（CAT），血浆白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平，以及脑组织凋亡细胞水平。结果:S组、I/ R组和D组NDS评分分别为4.25±3.15、45.56±8.59和23.00±8.83，D组显著高于S组(t=8.00,P＜0.05)而低于I/R组(t=7.32,P＜0.05)；三组脑组织相对含水量分别为59.58±0.06、87.87±0.06和80.52±0.04，D组显著高于S组(t=116.21,P＜0.05)而低于I/R组(t=40.76,P＜0.05)；三组MDA分别为0.89±0.13，2.67±0.52和1.85±0.51(nmol/mg)，D组显著高于S组(t=7.29,P＜0.05)而低于I/R组(t=4.50,P＜0.05)；SOD分别为82.33±13.17、32.06±6.34和57.89±9.74(U/mg)，D组显著低于S组(t=5.97,P＜0.05)而高于I/R组(t=8.89,P＜0.05)；CAT分别为85.13±9.08、22.25±3.69和52.43±6.75 CAT(U/mg)，D组显著低于S组(t=5.96,P＜0.05)而高于I/R组(t=8.89,P＜0.05)；三组大鼠血清IL-6分别为51.06±6.24、117.77±6.93和92.14±4.34(pg/mL)，D组显著高于S组(t=21.62,P＜0.05)而低于I/R组(t=12.54,P＜0.05)，TNF-α分别为40.98±9.29、85.31±9.64和55.89±7.39(pg/mL)，D组显著高于S组(t=5.02,P＜0.05)而低于I/R组(t=9.69,P＜0.05)；三组大鼠细胞凋亡分别为30.25±4.65，91.25±3.37和62.25±7.40，D组显著高于S组(t= 14.65,P＜0.05)而低于I/R组(t=14.27,P＜0.05)。结论：右美托咪定预处理通过抑制炎症和氧化应激反应，降低神经细胞凋亡，对2型糖尿病大鼠全脑缺血再灌注损伤产生了保护作用。

右美托咪定；糖尿病大鼠；缺血再灌注损伤；氧化应激；炎症反应

脑血管疾病严重威胁着人们的健康，其发病率、病死率及致残率有逐年上升的趋势。基础研究证明，右美托咪定具有神经保护作用，其机制主要通过作用于中枢α2-肾上腺素能受体，发挥抗炎抗氧化、抑制神经细胞凋亡的作用[1]。近年来，糖尿病是脑血管病的重要危险因素之一，高血糖可导致脑血管病变加重脑缺血再灌注损伤[2]。目前，右美托咪定对于糖尿病机体是否具有神经保护作用尚不清楚。我们在建立糖尿病大鼠全脑缺血再灌注损伤模型后，观察了右美托咪啶预处理对大鼠炎症因子及脑组织的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂 链尿佐菌素（streptozotocin,STZ）,美国Sigma公司产品。IL-6、TNF-α酶联免疫吸附试剂盒购自蓝基生物工程有限公司；SOD、MDA、CAT试剂盒购自南京建成生物有限公司；细胞凋亡试剂盒、DAB染色试剂盒购自德国罗氏公司；右美托咪定购自江苏恒瑞医药有限公司。

1.2 动物分组与处理 成年雄性SD大鼠60只，体质量200～220 g，平均（209±10）g，周龄8周。2型糖尿病大鼠模型造模成功后随机分为3组（n=16），分别为假手术组(S组)、缺血再灌注组（I/R组）、右美托咪定组（D组）。缺血前30 min，S组和I/R组静脉输注生理盐水120 min,输注速度2 mL/h。D组静脉输注右美托咪定，首次剂量6 μg/kg，10 min内输注，剩余剂量以0.05 μ g·kg-1·min-1持续静脉泵注120 min，输注速度2 mL/h（右美托咪定用生理盐水稀释）。

1.3 模型制备方法

1.3.1 2型糖尿病大鼠模型制备 造模前均自由饮食水，在恒定条件下[（21±2）℃，12 h白/12 h黑循环]每2只1笼饲养。高脂高糖饲料。在第6周和第9周禁食12 h，不禁水。经尾静脉再次注射1%STZ溶液(30 mg/kg)。观察大鼠的饮食尿及体质量的情况，STZ注射后72 h测量大鼠的随机血糖水平。挑选随机血糖水平≥16.7 mmol/L的大鼠进入实验。

1.3.2 全脑缺血再灌注损伤模型的制备 夹闭双侧颈总动脉联合低血压法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。异氟烷吸入诱导并维持麻醉，气管插管机械通气。穿刺大鼠股动脉、尾动静脉分别用来放血降压、有创血压监测、回输血液和泵药。分离双侧颈总动脉待夹闭。进行脑缺血处理，从股动脉放血到无菌容器内，10 min之内使大鼠的平均动脉压（MAP）降至（35±2）mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)水平，夹闭双侧颈总动脉。调节无菌容器内的血液量，保证MAP在（35±2）mmHg水平。全脑缺血时间为10 min。10 min后去掉动脉夹同时经尾静脉回输放出的血液，回输时间为10 min。回输结束，继续机械通气60 min。生命体征稳定后停药，拔除气管导管。围术期记录大鼠的血压、心率、氧分压、心电图、血气，维持体温为37℃。

1.4 检测指标

1.4.1 NDS评分 于缺血再灌注24 h测定大鼠感觉运动功能。NDS评分包括意识、呼吸、听力、嗅觉、视觉、胡须运动及角膜反射、运动及感觉功能、协调能力及有无癫痫发作等。神经功能完全正常为0分，脑死亡为100分。

1.4.2 脑组织含水量测定 于缺血再灌注24 h，每组取8只大鼠，断头取左侧脑皮质立即称重（湿重），放入70℃烘干箱3 d。3 d后称重（干重）。通过公式计算脑组织含水量：[（湿重-干重）/湿重]×100%。

1.4.3 脑组织MDA、SOD、CAT检测 于缺血再灌注24h，每组取8只大鼠，断头取海马组织，-80℃深低温冰箱保存。按照重量：体积比为1∶9比例的冰盐水制成10%的脑组织匀浆，BCA法测定匀浆蛋白浓度，分光光度计与酶标仪测定脑组织中MDA含量、SOD活性、CAT活性。

1.4.4 血浆IL-6、TNF-α的测定 于缺血再灌注24 h，每组取8只大鼠，取股动脉血液标本5 mL，3000 r/min离心15 min,取上清液（血浆），-80℃深低温保存。ELISA法检测血浆中IL-6、TNF-α含量。

1.4.5 脑组织凋亡细胞的检测 于缺血再灌注24 h，每组取8只大鼠，4%多聚甲醛灌注、固定，做海马冠状切片，行TUNEL染色。凋亡细胞的细胞核呈现棕黄色。使用光学显微镜观察在40倍视野下，由1名未知实验分组的实验员应用显微镜随机选取5个视野，每个视野选取100个细胞，进行TUNEL阳性细胞半定量分析。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 NDS评分及脑组织含水量 S组、I/R组和D组NDS评分分别为4.25±3.15、45.56±8.59和23.00± 8.83，D组显著高于S组(t=8.00,P＜0.05)而低于I/R组(t=7.32,P＜0.05)；三组脑组织相对含水量分别为59.58±0.06、87.87±0.06和80.52±0.04，D组显著高于S组(t=116.21,P＜0.05)而低于I/R组(t=40.76, P＜0.05)，见表1。

表1 3组大鼠神经功能缺损评分及脑组织含水量(±s)

表1 3组大鼠神经功能缺损评分及脑组织含水量(±s)

注：与S组比较，aP＜0.05；与I/R组比较，bP＜0.05

组别S组I/R组D组NDS评分4.25±3.15 45.56±8.59a23.00±8.83a、b脑组织含水量59.58±0.06 87.87±0.06a80.52±0.04a、b

2.2 脑组织MDA、SOD、CAT水平 S组，I/R组和D组MDA分别为0.89±0.13，2.67±0.52和1.85±0.51 (nmol/mg)，D组显著高于S组(t=7.29,P＜0.05)而低于I/R组(t=4.50,P＜0.05)；SOD分别为82.33± 13.17、32.06±6.34和57.89±9.74(U/mg)，D组显著低于S组(t=5.97,P＜0.05)而高于I/R组(t=8.89,P＜0.05)；CAT分别为85.13±9.08、22.25±3.69和52.43±6.75 CAT(U/mg)，D组显著低于S组(t=5.96, P＜0.05)而高于I/R组(t=8.89,P＜0.05)，见表2。

表2 3组大鼠脑组织MDA、SOD、CAT水平比较(±s)

表2 3组大鼠脑组织MDA、SOD、CAT水平比较(±s)

注：与S组比较，aP＜0.05；与I/R组比较，bP＜0.05

组别S组I/R组D组MDA(nmol/mg) 0.89±0.13 2.67±0.52a1.85±0.51a、b SOD(U/mg) 82.33±13.17 32.06±6.34a57.89±9.74a、b CAT(U/mg) 85.13±9.08 22.25±3.69a52.43±6.75a、b

2.3 血浆IL-6、TNF-α水平 S组，I/R组和D组大鼠血清IL-6分别为51.06±6.24、117.77±6.93和92.14±4.34(pg/mL)，D组显著高于S组(t=21.62,P＜0.05)而低于I/R组(t=12.54,P＜0.05)，TNF-α分别为40.98±9.29、85.31±9.64和55.89±7.39(pg/mL)，D组显著高于S组(t=5.02,P＜0.05)而低于I/R组(t= 9.69,P＜0.05)，见表3。

表3 3组大鼠血浆IL-6、TNF-α水平比较(±s，pg/mL)

表3 3组大鼠血浆IL-6、TNF-α水平比较(±s，pg/mL)

注：与S组比较，aP＜0.05；与I/R组比较，bP＜0.05

组别S组I/R组D组IL-6 51.06±6.24 117.77±6.93a92.14±4.34a、bTNF-α 40.98±9.29 85.31±9.64a55.89±7.39a、b

2.4 海马区凋亡细胞计数与TUNEL染色 S组，I/R组和D组大鼠细胞凋亡分别为30.25±4.65，91.25± 3.37和62.25±7.40，D组显著高于S组(t=14.65,P＜0.05)而低于I/R组(t=14.27,P＜0.05)，见图1。

3 讨论

采用高脂高糖饮食联合小剂量STZ溶液尾静脉注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型，很好地模拟了2型糖尿病患者身体状态，同时该方法也是2型糖尿病大鼠模型常用的制备方法[3-4]。夹闭双侧颈总动脉联合低血压法制备全脑缺血再灌注损伤模型，是目前研究全脑缺血再灌注损伤较常用的动物模型，该模型很好的模拟了大鼠脑组织缺血再灌注的病生理过程。这2种模型的结合，可用来模拟临床上糖尿病患者围术期发生的缺血性脑损伤。既往研究发现[5]，右美托咪定能够抑制糖尿病大鼠全脑缺血再灌注损伤，表现为降低NDS评分和脑组织含水量，抑制神经细胞凋亡。其机制可能与右美托咪定可以减轻糖尿病大鼠全脑缺血再灌注引起的炎症反应和氧化应激反应有关。

图1 三组大鼠海马区凋亡细胞TUNEL染色结果(A∶S组；B∶I/R组；C∶D组)

TNF-α和IL-6是重要的炎症因子，共同参与机体的炎症和免疫反应[6]。近年来，基础和临床研究发现，促炎因子在脑缺血再灌注损伤中起重要作用[7]。脑缺血再灌注损伤可引起脑组织、脑脊液、血浆中TNF-α和IL-6的水平升高[8]。原因是脑缺血再灌注后激活的脑组织细胞可分泌多种细胞因子，其主要有TNF-α和IL-6。炎性因子通过“细胞因子网络”，可对中枢神经系统发挥神经营养、神经保护及神经毒性双向作用。而在缺血再灌注状态下，高浓度的炎性因子TNF-α、白介素等参与了神经损伤[9]，介导血管内皮通透性增高，使得脑组织含水量增加，进一步导致脑组织水肿，水肿的神经细胞发生细胞核碎裂导致细胞凋亡[10]。研究证实，右美托咪定能够降低缺血再灌注后血浆中TNF-α、IL-6的水平，从而抑制炎症网络、降低缺血再灌注所导致的神经细胞凋亡。本实验研究发现，在全脑缺血再灌注损伤后24 h，右美托咪定能够降低糖尿病大鼠血浆中IL-6和TNF-α水平。表明右美托咪定对糖尿病的大鼠的脑损伤具有抗炎作用。

氧化应激参与了脑缺血再灌注损伤的全过程[11]。脑缺血可导致脑组织活性氧簇（ROS）增多，如O2-、H2O2[12]。ROS可引起细胞损伤，通过氧化细胞的脂质、蛋白、DNA片段，破坏细胞，导致细胞水肿，凋亡。脂质过氧化反应可使细胞膜的渗透性发生改变，促使溶酶体酶和线粒体基质酶进入细胞质，溶解细胞内的蛋白质，破坏细胞结构。MDA作为脂质过氧化反应的重要产物，是检测氧化应激反应的重要指标。当机体ROS产生增多时，机体会启动防御系（SOD和CAT）来起到自动调节维持细胞内环境稳定的作用。机体在正常情况下SOD可将O2-转换成H2O2，最后由CAT清除。发生脑缺血再灌注时，因为SOD和CAT浓度较低，ROS不能全部被分解清除[13]。本实验研究发现，与S组比较，I/R组和D组脑组织内MDA水平明显升高，SOD、CAT活性明显下降。D组脑组织内MDA水平比I/R组明显降低，SOD、CAT活性明显升高。表明糖尿病大鼠全脑缺血再灌注后发生了氧化应激反应，而给予右美托咪定后，降低了这种应激反应。因此，右美托咪定对糖尿病大鼠全脑缺血再灌注损伤具有抗氧化作用。

TUNEL染色是判定神经细胞凋亡的金指标。脑梗死时，脑组织的神经元，胶质细胞以及血管全部被破坏。而且，梗死周围的脑组织神经元也将走向坏死、凋亡[14]。以往研究发现，右美托咪定能够减少梗死范围改善神经元的转归，具有抑制神经细胞凋亡的作用[15-16]。本实验发现，与S组比较，I/R组和D组脑组织海马区凋亡细胞增多；D组脑组织海马区凋亡细胞比I/R组减少。表明右美托咪定对糖尿病大鼠全脑缺血再灌注损伤，具有抑制神经细胞凋亡的作用。

右美托咪定对糖尿病大鼠全脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，表现为降低NDS评分，减少脑组织水肿，抑制神经细胞凋亡。其原因可能与右美托咪定的抗炎抗氧化作用相关。但右美托咪定如何抑制缺血再灌注病理过程中炎性因子的产生及其确切分子机制目前并不十分清楚。因此，下一步应通过蛋白免疫印迹、免疫共沉淀等分子生物学技术，进一步探讨其抑制缺血再灌注损伤的分子机制，为临床应用提供更为可靠的证据。

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（收稿：2016-01-26 修回：2016-05-20）

（责任编辑 李文硕）

摘 要的具体要求

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Influence of Dexmedetomidine on Cerebral Injury in Diabetic Rats

WANG Peng,SHAN Shi-min,HAO Wei,et al.Department of Anesthesiology,Fifth Centre Hospital of Tianjin,Tianjin(300450),China

Objective To observe the effect of dexmedetomidine on cerebral injury in type 2 diabetic rats. Methods Sixty male,Sprague-Dawley rats(200～220 g)as animal models with type 2 diabetes mellitus were es⁃tablished.The rat models were randomly divided into 3 groups:sham-operation group(group S),ischemic-reper⁃fusion control group(group I/R)and dexmedetomidine group(group D),with 16 rats in each group.The animal models with global cerebral ischemia were established.The rats in group D,on 30 min before ischemia,were in⁃fused with dexmedetomidine 0.05 μg·kg-1·min-1over 120 min,while the rats in group S and group I/R were giv⁃en 0.9%sodium chloride solution 2ml/h instead.Neurologic deficit scores,brain water content,SOD activity, CAT activity,and MDA content of brain tissue and the IL-6,TNF-α in the plasma were tested,the number of TUNEL-positive neurons in ischemic hippocampus were observed 24 h after reperfusion. Results The NDS scores were 4.25±3.15,45.56±8.59 and 23.00±8.83 for group S,group I/R and group D respectively,which indi⁃cated D group was significantly higher than S group(t=8.00,P＜0.05)but statistically lower than I/R group(t= 7.32,P＜0.05)；The brain water contents were 59.58±0.06,87.87±0.06 and 80.52±0.04 for S group,I/R group and D group respectively,which indicated D group was significantly higher than S group(t=116.21,P＜0.05) but statistically lower than I/R group(t=40.76,P＜0.05).The MDA were 0.89±0.13，2.67±0.52 and 1.85±0.51 (nmol/mg)for S group,I/R group and D group respectively,which indicated D group was significantly higher than S group(t=7.29,P＜0.05)but statistically lower than I/R group(t=4.50,P＜0.05).The SOD were 82.33±13.17,32.06±6.34 and 7.89±9.74(U/mg)for Sgroup,I/R group and D group respectively,which indicated D group was significantly lower than S group(t=5.97, P＜0.05)but statistically higher than I/R group(t=8.89,P＜0.05).The CAT were 85.13±9.08、22.25±3.69 and 52.43±6.75 CAT(U/mg)for S group,I/R group and D group respectively,which indicated D group was significant⁃ly lower than S group(t=21.62,P＜0.05)but statistically higher than I/R group(t=8.89,P＜0.05).The serum IL-6 were 51.06±6.24、117.77±6.93 and 92.14±4.34(pg/mL)for S group,I/R group and D group respectively, which indicated D group was significantly higher than S group(t=21.62,P＜0.05)but statistically lower than I/R group(t=12.54,P＜0.05).The serum levels of TNF-α were 40.98±9.29,85.31±9.64 and 55.89±7.39(pg/mL)for S group,I/R group and D group respectively,which indicated D group was significantly lower than S group(t= 5.02,P＜0.05)but statistically higher than I/R group(t=9.69,P＜0.05).The apoptosis were 30.25±4.65，91.25± 3.37 and 62.25±7.40 for S group,I/R group and D group respectively,which indicated D group was significantly lower than S group(t=14.65,P＜ 0.05)but staitistically higher than I/R group(t=14.27,P＜ 0.05). Conclusion The dexmedetomidine has protective effects on global cerebral ischemia-reperfusion injury in dia⁃betic rats.

Dexmedetomidine;diabetes mellitus;ischemia-reperfusion injury;oxidative stress;inflammato⁃ry response

Q95-33;R971+.1

A

1007-6948(2016)04-0355-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.04.012

天津市第五中心医院麻醉科（天津 300450）

单世民,E-mail：15022171377@163.com