UPLC-QTRAP-MS/MS法同时测定苍耳类药材中酚酸、蒽醌及黄酮类成分

刘娟秀，罗益远，刘训红，宋建平，华愉教，王胜男

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.盐城卫生职业技术学院，江苏 盐城 224006)



UPLC-QTRAP-MS/MS法同时测定苍耳类药材中酚酸、蒽醌及黄酮类成分

刘娟秀1，罗益远1，刘训红1，宋建平2，华愉教1，王胜男1

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.盐城卫生职业技术学院，江苏 盐城 224006)

建立了超高效液相色谱-三重四极杆-线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS/MS)同时测定苍耳草、苍耳子药材中酚酸、蒽醌及黄酮类18种活性成分的方法。采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，以甲醇-0.2%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，柱温为35 ℃，选择电喷雾离子源(ESI)，负离子多反应监测(MRM)扫描方式检测。结果表明：在一定的浓度范围内，18种目标化合物的线性关系良好，线性相关系数均大于0.999 4，精密度、重复性和稳定性的RSD值均小于3%；加样回收率在96.81%～102.78%之间，RSD小于3%。该方法简便准确、灵敏度高、重复性好，适用于苍耳类药材中多元活性成分的同时测定，可为苍耳类药材内在质量的综合评价和全面控制提供方法参考。

苍耳草；苍耳子；超高效液相色谱-三重四极杆-线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS/MS)；酚酸；蒽醌；黄酮；同时测定

苍耳类药材苍耳草、苍耳子系菊科植物苍耳XanthiumsibiricumPatr.的地上部分和成熟带总苞的果实，为相同基源不同药用部位的药材[1]，分别记载于1989年版《江苏省中药材标准》和2015年版《中国药典》。苍耳草性微寒，具清风热、解毒之功效，主治鼻渊、风寒头痛、风湿痹痛、风疹、湿疹、疥癣等症，民间用药历史悠久[2]；苍耳子性温，具散风寒、通鼻窍、祛风湿之功效，为历代治疗鼻渊及头痛的要药[3]。现代研究表明，苍耳类药材含多种酚酸、蒽醌、黄酮类成分[4-6]，其中酚酸类成分具有抗炎、抗菌、抗血栓等作用[7-8]；蒽醌类成分具有抗菌消炎、抗病毒、降血脂、提高免疫等作用[9]；黄酮类成分具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[10-11]。中药疗效的发挥是多种成分综合作用的结果，针对苍耳类药材多种活性成分的特点，建立多元活性成分同时测定的方法，对探讨多指标成分的综合评价体系具有实用性和有效性。

目前，关于苍耳类药材的质量评价主要集中在酚酸、蒽醌及黄酮类成分的分析[12-17]，其分析方法多为高效液相色谱法(HPLC)[18-22]或高效毛细管电泳法(HPCE)[23]，尚未见上述多元活性成分同时测定的报道。液相色谱-串联质谱(LC/MS)技术具有高灵敏度、高选择性和高准确性等特点，其检测限可低至pg级，适用于化合物的快速定性定量分析[24]。

本实验拟采用超高效液相色谱-三重四极杆/线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS/MS)法同时测定苍耳草、苍耳子药材中酚酸、蒽醌和黄酮类成分的含量，并对不同商品药材的测定结果进行比较分析，考察其加工炮制前后目标成分的动态变化和同植株不同部位目标成分的积累差异，旨为苍耳类药材的安全性、有效性综合评价和内在质量的全面控制提供可靠的检测方法及科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器和材料

SIL-20A XR超快速液相色谱仪：日本岛津公司产品；API 5500四极杆-线性离子阱质谱仪：美国AB Sciex公司产品，配有Analyst Software 1.5.2数据采集处理工作站；ME36S型电子分析天平：德国赛多利斯公司产品；KQ-500E型超声波清洗器(功率500 W，频率40 kHz)：昆山市超声仪器有限公司产品；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海沪粤明科学仪器有限公司产品；H1650-W高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品。

绿原酸(批号：110753-200413)、阿魏酸(批号：110773-201012)、咖啡酸(批号：110885-200102)、芦荟大黄素(批号：110756-201007)、大黄素(批号：110756-200110)、大黄酚(批号：110796-201017)、槲皮素(批号：100081-200907)、芦丁(批号：0080-9705)、金丝桃苷(批号：111521-200303)、紫云英苷(批号：11092001)：纯度均大于98%，购于中国食品药品检定研究院；新绿原酸(批号：12112712)、隐 绿 原 酸(批号：12112605)、1,3-二咖啡酰奎宁酸(批号：12061112)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(批号：12022803)、4,5-二咖啡酰奎宁酸(批号：12022804)：纯度均大于98%，购于成都普瑞法科技开发有限公司；原儿茶醛(批号：YECQ20140819)、原儿茶酸(批号：YECS20140411)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(批号：YLYB2014041901)：纯度均大于98%，购于南京春秋生物工程有限公司；实验用水为超纯水；甲醇、甲酸：均为色谱纯，德国默克公司产品；其余试剂均为分析纯。

苍耳类药材经南京中医药大学中药鉴定教研室刘训红教授鉴定，S1～S18为苍耳草，系菊科植物苍耳XanthiumsibiricumPatr.的干燥地上部分；S19～S40为苍耳子，系菊科植物苍耳XanthiumsibiricumPatr.的干燥成熟带总苞的果实。其中，S26、S27分别为S23、S25根据2015年版《中国药典》(一部)炒苍耳子制法制得的对应炮制品；S18和S25为同一植株不同部位药材。S15～S25样品为实地采集，其余样品均为商品药材，留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室，详细情况列于表1。

表1 苍耳类药材样品的基本情况

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.2%甲酸水溶液(B)；梯度洗脱：0～10 min、20%～30%A，10～20 min、30%～35%A，20～30 min、35%～80%A，30～45 min、80%～100%A，45～48 min、100%～20%A；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量5 μL。

1.2.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，多反应监测模式(MRM)检测，检测离子为负离子，离子化温度550 ℃，喷雾电压-4 500 V，雾化气流速55 L/min，辅助气流速55 L/min，气帘气流速35 L/min。其他优化的质谱参数列于表2。

表2 18种目标化合物的质谱参数

1.3 溶液制备

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取1.62 mg绿原酸、1.46 mg新绿原酸、1.91 mg原儿茶醛、0.97 mg原儿茶酸、1.09 mg隐绿原酸、1.20 mg咖啡酸、1.18 mg 1,3-二咖啡酰奎宁酸、1.00 mg阿魏酸、1.43 mg 3,4-二咖啡酰奎宁酸、1.08 mg 3,5-二咖啡酰奎宁酸、1.12 mg 4,5-二咖啡酰奎宁酸、2.70 mg芦荟大黄素、2.97 mg大黄素、2.07 mg大黄酚、2.11 mg芦丁、1.55 mg槲皮素、1.78 mg紫云英苷、1.50 mg金丝桃苷对照品，分别置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，得对照品储备液。取各对照品母液适量，加入甲醇配制成含上述对照品的混合储备液，然后逐级稀释，得到一系列不同浓度的混合对照品溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，待分析。

1.3.2 供试品溶液的制备 精密称取1.0 g样品粉末(过3号筛)，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入40 mL 70%甲醇，称其质量后，于室温下超声(500 W，40 kHz)提取30 min，取出放冷，以70%甲醇补足质量损失，摇匀，提取液以12 000 r/min离心10 min；取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

1.4 分析方法

采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱对色谱条件进行优化，确定最佳的分离条件。按照优化的条件进行UPLC-QTRAP-MS/MS分析，采用外标法计算各样品中18种目标成分的含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件的优化

实验考察了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液等溶剂作为流动相的洗脱效果。由于甲醇可电离出[H+]，较乙腈有更高的响应和较好的峰形，故选用甲醇作为流动相的有机相。在流动相中加入一定比例的甲酸可增强样品中待测物的保留，减少色谱峰拖尾，从而提高方法的分离效率和灵敏度。经优化，选择甲醇-0.2%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱。

在质谱条件优化中，考察了正、负两种离子模式测定18种目标成分的响应特点。结果显示，18种目标成分在负离子模式下均有较强的响应，其提取离子流图及多反应监测质谱图示于图1。但在正离子模式下，咖啡酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、金丝桃苷、槲皮素、芦丁、紫云英苷成分的离子响应值较弱。因此，本实验选用负离子模式进行分析。

2.2 供试品制备方法的优化

实验对提取溶剂(50%、70%、90%、100%甲醇)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、提取时间(30、60、90、120 min)及提取方法(回流、超声处理)进行了考察。结果表明：采用70%甲醇作为溶剂可以提取出更多的待测物；以料液比1∶40，超声提取30 min具有较高的提取效率。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性方程、检测限和定量限 精密吸取1.3.1节中100 μL混合对照品溶液，置于10 mL容量瓶中，依次逐级稀释，制成一系列浓度的混合对照品溶液，按1.2节条件进样分析。以对照品峰面积(y)对相应浓度(x)进行线性回归，得到线性方程、相关系数和线性范围；以各化合物信噪比S/N=3时对应的浓度为最低检测限(LOD)，以各化合物信噪比S/N=10时对应的浓度为最低定量限(LOQ)，详细结果列于表3。

注：1.绿原酸；2.新绿原酸；3.原儿茶醛；4.原儿茶酸；5.隐绿原酸；6.咖啡酸；7.1,3-二咖啡酰奎宁酸；8.阿魏酸；9.3,4-二咖啡酰奎宁酸；10.3,5-二咖啡酰奎宁酸；11.金丝桃苷；12.芦丁；13.4,5-二咖啡酰奎宁酸；14.紫云英苷；15.芦荟大黄素；16.大黄素；17.大黄酚；18.槲皮素

表3 18种目标化合物的线性方程、相关系数、线性范围、方法检测限和定量限

2.3.2 精密度、稳定性和重复性 取一定浓度的混合对照品溶液，在1 d内连续进样6次，考察日内精密度；连续3 d，每天连续进样2次，考察日间精密度。取苍耳草(S7)样品供试品溶液，分别在0、2、4、6、12、24 h进样6次，测定18种目标成分峰面积的RSD，考察样品溶液中18种目标成分的稳定性。取约1.0 g苍耳子(S37)样品，按2.2节方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算18种目标成分含量及其RSD，考察方法的重复性。结果表明，仪器的精密度良好，18种目标成分在24 h内稳定，方法的重复性良好，详细结果列于表4。

2.3.3 加样回收率实验 取已知含量的0.5 g苍耳子(S37)样品，精密称定6份，分别精密加入一定量的上述对照品溶液，按2.2节方法制备供试品溶液，进样测定并计算18种目标成分的回收率，结果列于表5。

2.3.4 实际样品的测定 将供试品溶液注入液相色谱-质谱联用仪，按照1.2节条件测定，根据相应的线性关系计算供试样品中18种目标成分的含量，结果列于表6。

结果表明，苍耳类药材中18种目标成分的含量存在一定差异，其中以绿原酸、原儿茶酸含量较高，芦丁、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚含量较低。苍耳草药材中，3,4-二咖啡酰奎宁酸、芦丁、原儿茶酸含量差异较大；而苍耳子药材中，隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸含量差异较大。苍耳子药材中，酚酸、蒽醌和黄酮的总量均比苍耳草药材高，虽然这2个同基源不同药用部位的药材中化学成分类型基本一致，但含量差异明显，这可能是其功效不同的原因之一[25]。此外，苍耳子药材炮制前后，各化合物的含量发生变化，其中，生苍耳子(S23、S25)中酚酸、蒽醌和黄酮的总量高于炒苍耳子(S26、S27)；炒苍耳子中，新绿原酸、阿魏酸、原儿茶醛含量相对较高。就同一植株而言，阿魏酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、芦丁、紫云英苷在苍耳草(S18)中含量较高，其余化合物均以苍耳子(S25中)含量较高。

表4 18种目标成分的精密度、重复性和稳定性

表5 18种目标成分的加样回收率和相对标准偏差(n=6)

表6 实际样品的测定结果(μg/g，n=3，X±SD)

Table 6 Determination results of actual samples (μg/g,n=3,X±SD)

编号绿原酸新绿原酸隐绿原酸咖啡酸阿魏酸1,3-二咖啡酰奎宁酸3,4-二咖啡酰奎宁酸3,5-二咖啡酰奎宁酸4,5-二咖啡酰奎宁酸原儿茶醛原儿茶酸芦荟大黄素大黄素大黄酚芦丁槲皮素紫云英金丝桃苷S191.35±0.61120.77±0.4519.54±0.24390.81±0.6849.12±0.5541.49±0.2320.27±0.1317.68±0.1742.65±0.1947.82±0.37133.45±0.292.74±0.094.79±0.041.38±0.032.50±0.0435.81±0.322.55±0.0918.23±0.13S2248.65±0.06139.97±0.3966.88±0.1675.27±0.3877.19±0.10101.73±0.3560.33±0.1028.70±0.2478.21±0.1186.26±0.14381.66±0.292.68±0.034.47±0.061.55±0.0610.53±0.0855.95±0.194.71±0.12116.72±0.22S3104.40±0.57134.19±0.5137.75±0.32159.08±0.37133.19±0.1655.36±0.1421.33±0.2029.17±0.1653.58±0.1553.78±0.16140.79±0.212.64±0.032.95±0.104.46±0.069.55±0.0767.49±0.354.69±0.0524.23±0.58S4107.37±0.35131.92±0.4023.77±0.322.45±0.0551.75±0.2331.05±0.1130.57±0.2614.84±0.2441.16±0.0829.55±0.27121.64±0.282.68±0.011.19±0.031.47±0.0514.28±0.1543.59±0.3622.52±0.1841.37±0.22S591.72±0.35138.98±0.3427.34±0.20280.59±0.34136.60±0.2343.96±0.2421.58±05421.94±0.2066.76±0.0735.63±0.28170.35±0.262.67±0.041.76±0.050.92±0.0611.24±0.0641.84±0.284.42±0.1333.85±0.27S6169.49±0.72138.64±0.2250.22±0.212.46±0.0415.23±0.11114.30±0.2529.63±0.3451.25±0.1845.45±0.1961.84±0.12134.83±0.402.67±0.045.54±0.060.94±0.021.28±0.0460.96±0.115.19±0.0528.60±0.30S782.63±0.58138.01±0.3218.80±0.1544.54±0.516.84±0.1022.91±0.2116.69±0.1634.88±0.2451.57±0.1625.26±0.14155.14±0.092.74±0.080.90±0.080.85±0.030.44±0.0454.47±0.193.56±0.0652.20±0.20S8407.93±0.13141.08±0.4866.49±0.553.29±0.0839.45±0.2267.58±0.2172.52±0.3121.15±0.1448.79±0.3993.06±0.17327.58±0.332.69±0.040.90±0.030.57±0.056.64±0.1245.55±0.393.84±0.0810.27±0.32S987.02±0.17151.46±0.6119.23±0.1139.37±0.1435.13±0.1182.62±0.3822.68±0.4128.61±0.1322.35±0.2439.76±0.0690.25±0.132.75±0.071.90±0.021.08±0.031.16±0.0661.69±0.192.22±0.068.45±0.26S10315.54±0.45153.47±0.4678.61±0.292.54±0.0517.59±0.15340.99±0.2063.78±0.3835.60±0.2242.85±0.09112.64±0.15175.75±0.282.68±0.032.78±0.043.13±0.051.91±0.0561.94±0.183.76±0.1015.57±0.33S11185.60±0.39155.28±0.3230.21±0.1914.09±0.1350.03±0.22102.03±0.2682.96±0.1717.54±0.2669.26±0.2730.88±0.19310.91±0.302.72±0.082.85±0.034.90±0.044.73±0.1244.31±0.1912.65±0.2932.95±0.20S1265.19±0.22151.30±0.5717.00±0.1281.23±0.1646.84±0.2830.66±0.580.08±0.0131.59±0.2321.82±0.1130.86±0.1479.20±0.172.71±0.051.71±0.021.58±0.063.85±0.0942.96±0.152.76±0.2510.21±0.14S1326.81±0.24160.67±0.519.69±0.15117.52±0.307.06±0.1212.61±0.305.25±0.1521.95±0.079.43±0.0818.55±0.4829.77±0.312.73±0.061.45±0.041.32±0.0648.67±0.1540.87±0.491.83±0.125.75±0.10S14423.20±0.10164.81±0.4970.76±0.2229.41±0.2919.66±0.4197.82±0.33180.44±0.4119.14±0.1038.75±0.2052.25±0.10355.85±0.112.65±0.031.53±0.040.82±0.062.66±0.0963.89±0.317.18±0.1516.36±0.21S15941.11±0.74168.00±0.17182.14±0.1917.62±0.38274.91±0.25175.97±0.43328.17±0.2333.54±0.1980.43±0.0874.30±0.24779.74±0.542.66±0.041.43±0.022.62±0.050.37±0.0553.84±0.4250.32±0.24379.54±0.54S16482.29±0.14164.80±0.3088.48±0.6919.48±0.18111.77±0.32218.38±0.14130.50±0.3731.95±0.1176.71±0.2270.98±0.14523.64±0.232.66±0.021.07±±0.031.08±0.050.43±0.0543.94±0.1924.75±0.08223.37±0.29S17339.03±0.50164.78±0.2658.57±0.5328.40±0.22220.34±0.44273.77±0.3255.90±0.6025.85±0.1177.16±0.0559.75±0.12467.03±0.202.65±0.040.86±0.050.83±0.030.75±0.0352.70±0.1330.87±0.27186.97±0.55S18480.63±0.65145.27±0.25161.12±0.7215.81±0.40377.77±0.17364.92±0.27113.71±0.5218.15±0.0976.29±0.1439.58±0.12156.95±0.582.66±0.020.88±0.040.86±0.058.65±0.2041.28±0.2263.35±0.36198.68±0.48S19734.16±0.67170.14±0.38504.80±0.4661.24±0.29367.82±0.29143.94±0.22166.50±0.5416.42±0.1763.54±0.3464.77±0.18671.05±0.492.67±0.032.84±0.081.45±0.050.38±0.04147.95±0.0812.57±0.06196.73±0.44S20881.78±0.41154.15±0.74692.88±0.3529.03±0.30407.83±0.26195.17±0.32275.48±0.3319.69±0.1492.61±0.4846.12±0.18375.09±0.552.71±0.068.30±0.051.29±0.064.74±0.07151.11±0.1531.54±0.14382.33±0.42S21910.99±0.37155.62±0.63695.89±0.3837.80±0.361031.03±0.59143.05±0.17417.24±0.2331.87±0.1797.39±0.1446.68±0.13477.71±0.372.71±0.051.25±0.041.22±0.060.34±0.05125.76±0.255.90±0.25201.68±0.27

续表6

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱-三重四极杆-线性离子阱质谱法同时测定苍耳草、苍耳子药材中酚酸、蒽醌和黄酮类18种活性成分的含量，并对不同商品药材、加工炮制前后及同植株不同部位中化合物的含量进行比较分析。结果发现，苍耳类药材中酚酸、蒽醌及黄酮等18种成分的含量存在一定差异，其中苍耳子药材的酚酸、蒽醌和黄酮的总量均比苍耳草药材高。苍耳草药材中，3,4-二咖啡酰奎宁酸、芦丁、原儿茶酸含量差异较大；苍耳子药材中，隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸含量差异较大。苍耳子药材炮制前后，目标化合物含量发生变化，生苍耳子中酚酸、蒽醌和黄酮的总量高于炒苍耳子。同植株不同部位药材中，苍耳草中阿魏酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、芦丁、紫云英苷含量较高，其余化合物均以苍耳子含量较高。该方法可为苍耳类药材内在质量的综合评价和全面控制提供可靠的检测方法。

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Simultaneous Determination of Phenolic Acids,Anthraquinones and Flavonoids inXanthiiHerbaandXanthiiFructusby UPLC-QTRAP-MS/MS

LIU Juan-xiu1, LUO Yi-yuan1, LIU Xun-hong1, SONG Jian-ping2,HUA Yu-jiao1, WANG Sheng-nan1

(1.NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China;2.YanchengHealthVocational&TechnicalCollege,Yancheng224006,China)

A comprehensive analytical method based on UPLC-QTRAP-MS/MS was developed for the simultaneous determination of eighteen bioactive components including phenolic acids, anthraquinones and flavonoids inXanthiiHerbaandXanthiiFructus. Under the optimized chromatographic conditions, extracts of eighteen target components were obtained on an Agilent ZORBAX SB-C18 column (250 mm×4.6 mm×5 μm) using methanol-0.2% formic acid as mobile phases for gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 35 ℃. The target compounds were analyzed in the negative ion multiple reaction monitoring (MRM) mode. The results show that eighteen components have good linearity, the correlation coefficients of all the calibration curves are higher than 0.999 4. Relative standard deviations (RSDs) of precision, repeatability and stability are lower than 3%. The recoveries range from 96.81% to 102.78%, and the RSDs are less than 3%. The established method is accurate, sensitive, and has good repeatability. It is suitable for simultaneous determination of eighteen components inXanthiiHerbaandXanthiiFructus, which can provide a reliable and effective technique for the quality control ofXanthiiHerbaandXanthiiFructus.

XanthiiHerba;XanthiiFructus; UPLC-QTRAP-MS/MS; phenolic acids; anthraquinones; flavonoids; simultaneous determination

2015-12-01;

2015-03-13

江苏高校优势学科建设工程资助项目(YSXK-2014)；盐城市医学科技发展计划项目(YK2014051)资助

刘娟秀(1990—)，女(汉族)，江苏人，硕士研究生，生药学专业。E-mail: liujx0516@163.com

刘训红(1959—)，男(汉族)，江苏人，教授，从事中药鉴定与品质评价研究。E-mail: liuxunh1959@sohu.com

时间：2016-07-05；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160705.1357.024.html

O657.63

A

1004-2997(2016)06-0542-12

10.7538/zpxb.youxian.2016.0026