高分离快速液相色谱-四极杆飞行时间质谱法检测人参皂苷Re在大鼠体内的分布

王恩鹏，斋藤哲男，孙 岩，陈长宝，刘淑莹

(1.长春中医药大学，吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117；2.新泻药科大学应用生命科学研究院，日本 新泻市 956-8603)



高分离快速液相色谱-四极杆飞行时间质谱法检测人参皂苷Re在大鼠体内的分布

王恩鹏1，斋藤哲男2，孙 岩1，陈长宝1，刘淑莹1

(1.长春中医药大学，吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117；2.新泻药科大学应用生命科学研究院，日本 新泻市 956-8603)

建立了高分离快速液相色谱-四极杆飞行时间质谱(RRLC-Q-TOF MS)法检测大鼠尾静脉注射人参皂苷Re(G-Re)后，不同组织(心、肝、脾、肺、肾、脑)中G-Re的分布情况。样本经蛋白沉淀处理，Supelco Ascentis®Express C18色谱柱(50 mm×3.0 mm×2.7 μm)分离，采用含0.1%甲酸的水溶液(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱，以人参皂苷Rc(G-Rc)作为内标，在电喷雾负离子模式下检测。结果表明：组织匀浆标准曲线的线性范围为10～20 000 μg/L，线性关系良好(r>0.99)，最低检出限(S/N=3)为3 μg/L，最小定量限为10 μg/L；准确度、日内和日间精密度、提取回收率均符合生物样品的分析要求。大鼠尾静脉注射20 mg/kg G-Re溶液后，在大鼠体内不同组织中均能检测到G-Re，主要分布在肺、脾、肾、心、脑、肝等器官，其中在肺中分布最多，在肝中分布最少。该方法简单、灵敏、快速、检出限低，适用于检测人参皂苷Re在生物体内的分布。

高分离快速液相色谱-四极杆飞行时间质谱(RRLC-Q-TOF MS)；人参皂苷Re；静脉注射；组织分布

人参系五加科植物，被称为“百草之王”，在传统中医药中占据重要地位。目前，人参在中国、韩国、日本、俄罗斯、美国和加拿大[1]等国家被广泛种植，它作为一种补充食品深受人们欢迎[2-3]。人参皂苷Re是人参皂苷中的主要成分，具有良好的抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等功效，对于缺血性心律失常、体液免疫和细胞免疫均有较好的作用[4-6]，其结构示于图1。近年来，有许多关于人参皂苷Re的体内代谢及药代动力学研究的报道。如，Bae等[7]利用高效液相色谱法对人参皂苷Re的肠内菌群代谢产物进行检测，结果表明，G-Re在体内代谢的主要初级产物为人参皂苷Rg1，其继续水解可生成人参皂苷Rh1和Rf1。陈广通等[8]利用HPLC-ESI-MS/MS法从口服G-Re大鼠的粪便中检测出6个代谢产物，分别是20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、人参皂苷F1、3-羰基人参皂苷Rh1和原人参三醇。彭缨等[9]采用HPLC法测定大鼠静脉注射3种不同剂量(20、30、40 mg/kg)G-Re后的血药浓度，结果表明，3组大鼠的药代动力学参数成双隔室型，在该剂量范围内 G-Re的消除为线性动力学。近年来，人们在研究人参皂苷血浆药物浓度的同时，其组织分布也受到重视，两者结合能更好地阐明人参皂苷Re的体内代谢过程，有效地评价生物利用度[10]。

图1 人参皂苷Re的化学结构式

目前，人参皂苷的分析多采用高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV)法，但该方法的分析时间长[11-12]，特别是分析生物样本时需要30 min以上[13]。且由于生物样品中内源性干扰较多，影响了测定的准确度和灵敏度，液相色谱在没有标准品的情况下，不利于目标成分的准确测定和确认。高分离快速液相色谱-四极杆飞行时间质谱(RRLC-Q-TOF MS)法作为中药生物样品多成分复杂体系的分析工具，将快速液相色谱仪与高分辨质谱仪连接，液相色谱部分采用高压双元泵，提高了流动相的压力与流速，同时使用2.7 μm粒径填料的色谱柱，可明显加快分析速度。与常规的HPCL-UV相比，该方法具有准确度好、专属性强、灵敏度高、分析速度快等优点[14-18]，能够提高生物样品的分析效率，现已被广泛用于药物鉴定、代谢组学、药代动力学等领域的研究[11-12,19-21]。

本研究拟采用RRLC-Q-TOF MS法考察大鼠静脉注射人参皂苷Re后的组织分布特征，并对其进行专属性、线性范围及检测限、精密度与准确度、提取回收率、检测限和稳定性的考察，旨为进一步开发利用人参皂苷Re奠定基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200系列RRLC系统、Agilent 6520 Q-TOF质谱仪：美国Agilent公司产品，配有ESI离子源和Mass Hunter数据处理系统；WS2-261-79型电热恒温水浴箱：北京长安科学仪器厂产品；高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司产品；DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机：宁波新芝生物科技股份有限公司产品；超低温冰箱：美国Thermo公司产品；MTN-2800D型氮吹仪：天津奥特塞恩斯仪器有限公司产品。

人参皂苷Re、Rc标准品(色谱级，纯度>98%)：购自吉林大学药学院；乙腈(色谱级)：美国Tedia公司产品；甲酸(色谱级)：美国Sigma公司产品；超纯水：由美国Millipore公司的Milli-Q系统制得。

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件 Supelco Ascentis®Express C18 HPLC色谱柱(50 mm×3.0 mm×2.7 μm)；流动相：A为含0.1%甲酸的超纯水，B为乙腈；梯度洗脱：0～15 min、20%～40%B，15～20 min、40%～50%B，20～22 min、50%～100%B，22～25 min、100%B；柱温35 ℃；流速0.3 mL/min；进样量5 μL。

1.2.2 质谱条件 电喷雾负离子电离模式，气体温度350 ℃，干燥气流速9 L/min，喷雾气压276 kPa，毛细管电压3.5 kV，裂解电压175 V，锥孔电压65 V，质量扫描范围m/z50～1 000。样品测试前，使用调谐液校正质量轴。

1.3 溶液配制和样品处理

1.3.1 标准溶液和内标溶液的配制 精密称取1.00 mg人参皂苷Re标准品，用甲醇稀释至1 mL，配制成浓度为1 g/L的母液；然后用甲醇稀释成浓度为1、10、100 mg/L的工作液。精密称取1.00 mg人参皂苷Rc标准品，用甲醇定容至2 mL，配制成浓度为0.5 g/L的内标溶液。

1.3.2 标准曲线的绘制 分别取100 μL空白大鼠的组织(心、肺、脾、肾、脑、肺)匀浆清液于1.5 mL Eppendorf管中。向每个样品中加入不同质量的人参皂苷Re，配制成浓度分别为10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 μg/L的系列标准溶液；加入10 μL 1 g/L人参皂苷Rc作为内标，用移液枪混匀，再加入300 μL甲醇，涡旋5 min，以13 000 r/min离心10 min，取上清液；经0.45 μm滤膜过滤，进样检测。以人参皂苷Re浓度为横坐标x，G-Re与G-Rc的峰面积比值(A/Ai)为纵坐标y，进行线性回归，绘制标准曲线。

1.3.3 动物实验 25只雄性Wistar大鼠，体重(200±30) g，动物合格证号：SCXK-(吉)2011-0007，由长春生物制品有限公司动物中心提供。在标准环境下(湿度(50±10)%，温度(25±2) ℃，12 h 昼夜循环)进食进水，实验前禁食12 h。

1.3.4 样品的采集与制备 将25只大鼠随机分为5组，其中1组为空白对照组，其余4组分别在尾静脉注射20 mg/kg人参皂苷Re，在0.5、1、2、4、8 h后处死，取心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器，以蒸馏水洗净，称其质量；按质量-体积比1∶5向各组织中加入生理盐水，冰上匀浆后，置于预置好的4 ℃高速冷冻离心机内，以3 000 r/min离心10 min，取上清液于冻干机内冻干；加入1 mL甲醇，涡旋5 min，超声溶解15 min，转移至1.5 mL Eppendorf管内，置于预置好的4 ℃高速冷冻离心机内，以13 000 r/min离心10 min，取上清液；45 ℃下氮气吹干，向每个样品中加入10 μL 1 g/L人参皂苷Rc内标溶液，用流动相定容至1 mL，制成浓度为10 mg/L的溶液；经0.45 μm滤膜过滤，置于4 ℃冰箱中，待测。

2 结果与讨论

2.1 专属性考察

以大鼠的肺脏组织为例，在电喷雾负离子模式下，其总离子流图示于图2。通过比较供试空白组织色谱图、向空白组织中加入待测物和内标物后得到的总离子流图(TIC)、提取离子流图(EIC)和给药后不同时间测得的色谱图，发现组织中所含内源性物质不干扰被测物和内标物的测定，被测物峰形良好；在1.2.1和1.2.2节条件下，G-Re和内标G-Rc的保留时间分别为 6.956 min和13.410 min。

2.2 线性范围及检测限

大鼠组织样本的线性范围和标准曲线列于表1。可以看出：该方法的线性关系良好(r>0.99)，以S/N≥3计算方法的最低检出限(LLOD)为3 μg/L。

注：a.空白大鼠肺脏总离子流图；b.向空白组织中加入G-Re与内标物的总离子流图；

表1 大鼠组织样本的标准曲线，相关系数和线性范围

Table 1 Standard calibration curves,correlation coefficients and liner ranges of G-Re in rats tissue samples

组织样本线性回归方程相关系数(r)线性范围/(μg/L)心y=0.0283x—0.02730.999310～20000肝y=0.0322x—0.01650.997110～20000脾y=0.0449x—0.05040.996910～20000肺y=0.0249x+0.03870.997610～20000肾y=0.0219x+0.01580.998610～20000脑y=0.0284x—0.02860.999410～20000

2.3 精密度与准确度

按1.3.2节方法分别配制G-Re各组织匀浆液高、中、低3个浓度(3、30、300 μg/L)的质量控制(QC)样品，每个浓度进行5样本分析，连续测定3 d，为保持实验条件一致，标准曲线的测定与上述样品测定同时进行。根据当日标准曲线计算QC样品浓度(C1～C3)，与配制浓度(C1′～C3′)对照，将QC样品的结果进行计算，通过每一浓度的2种处理方法的浓度比值(C/C′)计算回收率，得出方法准确度，通过计算二者的浓度相对标准偏差得出方法的精密度。方法的准确度和精密度列于表2。结果表明：G-Re在各组织匀浆液中的日内和日间精密度RSD均小于20%，准确度在90.0%～110.0%范围内。

表2 质量控制样品的日内、日间精密度和准确度(n=5)

2.4 提取回收率

按1.3.2节方法分别配制G-Re各组织匀浆液高、中、低3个浓度的QC样品，每个浓度进行5样本分析，连续测定3 d，为保持实验条件一致，标准曲线的测定与上述样品测定同时进行。根据当日标准曲线计算QC样品浓度，与配制浓度对照，将QC样品的相应峰面积记为A1；另取各空白组织匀浆液，离心后得上清液，分别加入上述低、中、高浓度的标准溶液(每个浓度进行3样本分析)进样分析，获得相应的峰面积值A2；以每一浓度的2种处理方法的峰面积比值(A1/A2)计算提取回收率。以肺匀浆液为例，提取回收率分别为(91.6±1.0)%、(90.9±3.9)%、(93.2±2.3)%，内标(IS)回收率为(98.2±1.1)%。

2.5 稳定性考察

按1.3.2节方法分别配制G-Re各组织匀浆液高、中、低3个浓度的QC样品，每个浓度进行3样本分析。分别将样品在室温(约20 ℃) 下放置 6 h、4 ℃下冷藏8 h、-20 ℃冻融循环3次，经处理后进样测定，考察大鼠的各个组织匀浆液中G-Re在室温、冷藏、反复冻融条件下的稳定性。以每一浓度3样本分析，3种情况下得到的G-Re峰面积与时间点的偏差均在15%以内，说明各组织匀浆液中的待测物稳定性良好。

2.6 组织分布考察

大鼠尾静脉注射20 mg/kg G-Re溶液后，在大鼠体内不同时间点(0.5、1、2、4、8 h)各组织中G-Re的分布情况示于图3。结果表明：在心、肝、脾、肺、肾、脑等6种组织器官中均能检测到G-Re，G-Re在各组织中的分布迅速且具有不均衡性，其含量排序为：肺>脾>肾>心>脑>肝。

图3 大鼠尾静脉注射20 mg/kg G-Re后，G-Re在各组织中的浓度变化

3 结论

本研究建立了RRLC-Q-TOF MS法测定人参皂苷Re在大鼠体内的分布，该方法简便快速、专属性强、灵敏度高、分析效率好，可弥补人参皂苷类物质在紫外吸收差、检测限值高的缺陷。RRLC液相色谱仪结合2.7 μm粒径填料色谱柱的使用，提高了色谱的分离效率，加快了分析速度。质谱检测采用电喷雾负离子电离模式，在尾静脉注射G-Re大鼠的6种主要组织器官中均能检出G-Re，不同组织样本中的G-Re定量范围在10～20 000 μg/L之间。该方法适用于生物样品中人参皂苷类成分的高通量分析。

[1] LU J M, YAO Q, CHEN C, et al. Ginseng compounds: An update on their molecular mechanisms and medical applications[J]. Current Vascular Pharmacology, 2009, 7(3): 293-302.

[2] ZUCCHI O L, MJ O J E. Characterization of hypoglycemiant plants by total reflection X-ray fluorescence spectrometry[J]. Biological Trace Element Research, 2005, 103(103): 277-290.

[3] MURTHY H N, GEORGIEV M I, KIM Y S, et al. Ginsenosides: Prospective for sustainable biotechnological production[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2014, 98(14): 6 243-6 254.

[4] 何道同，王兵，陈珺明. 人参皂苷药理作用研究进展[J]. 辽宁中医药大学学报，2012,(7):118-121.

HE Daotong, WANG Bing, CHEN Junming, et al. Research progress on pharmacological effects of ginsenoside[J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2012, (7): 118-121(in Chinese).

[5] ATTELE A S, ZHOU Y P, XIE J T, et al. Antidiabetic effects ofPanaxginsengberry extract and the identification of an effective component[J]. Diabetes, 2002, 51(6): 1 851-1 858.

[6] ZHANG Z G, LI X Y, LV W S, et al. Ginsenoside Re reduces insulin resistance through inhibition of c-Jun NH2-terminal kinase and nuclear factor-κB[J]. Molecular Endocrinology, 2008, 22(1): 186-195.

[7] BAE E A, SHIN J E, KIM D H. Metabolism of ginsenoside Re by human intestinal microflora and its estrogenic effect[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2005, 28(10): 1 903-1 908.

[8] 陈广通，杨敏，果德安. 人参皂苷Re在大鼠体内的代谢研究[J]. 中国中药杂志，2009, 34(12):1 540-1 543.

CHEN Guangtong, YANG Min, GUO Dean, et al. Metabolic study of ginsenoside Re in rats[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2009, 34(12): 1 540-1 543(in Chinese).

[9] 彭缨，王淑君，潘卫三，等. 人参皂苷Re大鼠体内药物动力学研究[J]. 沈阳药科大学学报，2006,23(4):4-7.

PENG Ying, WANG Shujun, PAN Weisan. Pharmacokinetics of ginsenoside Re in rat[J]. Journal of Shenyang Pharmaceutical University, 2006, 23(4): 4-7(in Chinese).

[10]LEE J, LEE E, KIM D, et al. Studies on absorption, distribution and metabolism of ginseng in humans after oral administration[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2009, 122(1): 143-148.

[11]陈英红，姜瑞芝，罗浩铭，等. 人参总皂苷提取物指纹图谱研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2009,15(11):12-14.

CHEN Yinghong, JIANG Ruizhi, LUO Haoming, et al. Studies on the HPLC fingerprints of general ginsenosidein the extract of Ginseng Radix[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2009, 15(11): 12-14 (in Chinese).

[12]张金秋，夏娟，孙光芝，等. RP-HPLC法测定人参花中11个人参皂苷含量[J]. 药物分析杂志，2015,(9):1 596-1 600.

ZHANG Jinqiu, XIA Juan, SUN Guangzhi, et al. Determination of 11 kinds of ginsenosides fromGinsengBudby RP-HPLC[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2015, (9): 1 596-1 600(in Chinese).

[13]马静，李学林，唐进法，等. 不同途径给药参麦注射液中人参皂苷Rg1及Re在大鼠体内药代动力学研究[J]. 中药药理与临床，2012,(2):9-11.

MA Jing, LI Xuelin, TANG Jinfa, et al. Pharmacokinetic study on ginsenoside Rgl and Re in rats following intravenous and oral administration of Shenmai injection[J]. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica, 2012, (2): 9-11(in Chinese).

[14]WU W，QIN Q J, GUO Y Y, et al. Studies on the chemical transformation of 20(S)-protopanaxatriol (PPT)-type ginsenosides Re, Rg2, and Rf using rapid resolution liquid chromatography coupled with quadruple-time-of-flight mass spectrometry (RRLC-Q-TOF-MS)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(40): 10 007-10 014.

[15]WEN X D, LIU E H, YANG J. Identification of metabolites of Buyang Huanwu decoction in rat urine using liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2012, 67/68(3): 114-122.

[16]NIU J, PI Z F, YUE H, et al. Effect of ginseng polysaccharide on the urinary excretion of type 2 diabetic rats studied by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2012, 907(20): 7-12.

[17]WANG P X, LI Y H, Y J, et al. Determination of protopine in rat brain tissues by RRLC-ESI/Q-TOF-MS method[J]. Chinese Herbal Medicines, 2014, 6(2): 125-130.

[18]SUN J H, WU W, GUO Y Y, et al. Pharmacokinetic study of ginsenoside Rc and simultaneous determination of its metabolites in rats using RRLC-Q-TOF-MS[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014, 88(Complete): 16-21.

[19]LIU J, CHEN X Y, HU Y H, et al. Quantification of the major metabolites of bromhexine in human plasma using RRLC-MS/MS and its application to pharmacokinetics[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2010, 51(5): 1 134-1 141.

[20]WANG Y, MA L, SUN Y, et al. Metabonomics study on the hot syndrome of traditional Chinese medicine by rapid resolution liquid chromatography combined with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry[J]. Archives of Pharmacal Research, 2014, 37(7): 1-8.

[21]WU W, SUN L, ZHANG Z, et al. Profiling and multivariate statistical analysis ofPanaxginsengbased on ultra-high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2015, 107: 141-150.

Tissue Distribution of Ginsenoside Re in Rats by Rapid Resolution Liquid Chromatography Coupled With Quadrupole-Time-of Flight Mass Spectrometry

WANG En-peng1, SAITO Tetsuo2, SUN Yan1, CHEN Chang-bao1, LIU Shu-ying1

(1.JilinGinsengAcademy,ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China;2.DepartmentofAppliedLifeSciences,NiigataUniversityofPharmacy&AppliedLifeSciences,Higashijima265-1,Niigata956-8603,Japan)

A method of rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of flight mass spectrometry (RRLC-Q-TOF MS) was established to investigate the distribution of ginsenoside Re (G-Re) in rat various tissues (heart, liver, spleen, lung, kidney and brarin) after a single administration by intravenous injection. The biological samples were prepared by protein precipitation. Chromatographic separations was achieved on a Supelco Ascentis®Express C18 column (50 mm×3.0 mm×2.7 μm) with a mobile phase consisting of solvent A (0.1% formic acid in water) and solvent B (acetonitrile) at a flow rate of 0.3 mL/min. Gradient elution was as follows: 0-15 min, 20%-40%B; 15-20 min, 40%-50%B; 20-22 min, 50%-100%B. Ginsenoside Rc (G-Rc) was used as internal standard (IS). All mass spectrometric experiments were performed on RRLC-Q-TOF MS equipped with an electrospray ionization (ESI) source operated in negative mode. The result shows that the calibration curve is linear in the range of 10-20 000 μg/L for tissue homogenates (r>0.99), the lower limit of detection (LLOD) is 3 μg/L, and the lower limit of quantification (LLOQ) is 10 μg/L. The accuracy, intra-day, inter-day precision and recovery ratio can meet the requirements of the biological samples analysis. As a result, G-Re could be widely distributed in organizations with 20 mg/kg solution by caudal vein injection, which could be detected in different organs and distributed mainly in the lung, spleen, kidney and heart. Lung had a highest affinity to G-Re, which was not easy to pass through the blood-brain barrier and hard to accumulate. This method is simple, sensitive and rapid, which is suitable for analyzing ginsenosides Re in vivo.

rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of flight mass spectrometry (RRLC-Q-TOF-MS); ginsenoside Re; intravenous injection; tissue distribution

2015-12-30;

2016-04-08

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(20150344)；长春市科技局重大科技攻关项目(14KG057)资助

王恩鹏(1983—)，男(汉族)，吉林人，助理研究员，从事中药化学研究。E-mail: robbinwang913@163.com

刘淑莹(1943—)，女(汉族)，黑龙江人，教授，从事中药化学和有机质谱学研究。E-mail: syliu19@yahoo.com.cn

时间：2016-09-01；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160901.1500.002.html

O657.63

A

1004-2997(2016)06-0526-07

10.7538/zpxb.youxian.2016.0038