饲料中维生素B2测定的色谱条件优化

邢磊，杨琳芬*，符金华，姜文娟，尹腾桂，金海红，樊晶

（江西省兽药饲料监察所，江西南昌330096）

饲料中维生素B2测定的色谱条件优化

邢磊1，杨琳芬1*，符金华2，姜文娟3，尹腾桂4，金海红5，樊晶6

（江西省兽药饲料监察所，江西南昌330096）

本实验建立了高效液相色谱法测定饲料中维生素B2的含量。采用了国标法和优化法两种方法进行测定。国标法∶按照GB/T14701-2002的方法进行。优化方法∶采用Agilent-1260高效液相色谱仪，ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5-M icrom）色谱柱；流动相A液∶1.1003 g庚烷磺酸钠和0.0502 g EDTA及25 m L冰乙酸、5 m L三乙胺溶液，用冰乙酸、三乙胺调节pH值至3.4；B液为甲醇；A∶B=85∶15；检测波长∶265 nm；柱温∶35℃；流速∶1.0 m L/m in；进样量∶0.5 μL。结果表明∶国标法的保留时间为70 m in左右，优化法的保留时间为9 m in，且优化法的相关系数、重复性和精密度都满足要求。可见优化法测定所需时间更短，更具有快速、精确测定等优点。

高效液相色谱法；维生素B2；色谱条件优化

维生素是一类分子量较小的有机化合物，在动物机体内发挥着与三大营养物质完全不同的作用，是动物生长所必需的营养物质，是动物饲料中必需添加的物质，它与动物的生命健康、生长发育及生产都有着密切的联系。王晴（2000）认为，随着动物养殖行业的发展，近年来，市场上出现了多种维生素B2的添加剂，因此，建立快速、准确的检测分析方法是必要的。在本实验中采用了两种高效液相色谱条件检测饲料中维生素B2的含量，根据两种色谱条件下测定结果的比较找到一种更为快速、准确测定饲料中维生素B2含量的液相色谱条件。

1　材料与方法

1.1试剂核黄素标准品（SIGMA）、冰乙酸、三乙胺（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、甲醇（分析纯）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、庚烷磺酸钠。

1.2仪器本实验中采用了Agilent-1260高效液相色谱仪（USA Agilent Technologies，包括Agilent Technologies 1260 Infinity紫外检测器）、TGL—16G离心机（上海安亭科学仪器厂）、电子天平（常州宏衡）、津腾过滤器（津腾T-50）、过滤膜（法利特ф50 mm×0.45 μm）、超声波清洗器（AS3120）及其他常规实验仪器。

1.3样品饲料A（5%青年蛋鸡复合预混合饲料）、饲料B（10%后备母猪复合预混合饲料）。

1.4样品前处理

1.4.1试样溶液的配制称取A、B两组复合预混合饲料（每组两个饲料样品为平行样）1～3 g。将其分别加入四个100 mL的棕色容量瓶中，加入维生素B2提取液至约容量瓶2/3体积处，将容量瓶置于80～100℃水浴锅中煮沸30 min，待其自然冷却后加入14 mL的甲醇，最后用维生素B2提取液定容至刻度，混匀后，用0.45 μm滤膜过滤后待上机测定。

1.4.2样品上机前处理将工作液（见下面标准工作液的配制）和两组四个试样液分别装入离心管中，12000 r/min离心12 min，然后装入到进样瓶中待上机检测。

1.5试剂配制

1.5.1流动相的配制A液:25 mL冰乙酸（CH3COOH）+5 mL三乙胺[（C2H5）3N]+0.0502 g乙二胺四乙酸二钠（EDTA:C10H16N2O8）+1.1000 g庚烷磺酸钠（C7H15NaO3S），最后用超纯水定容至1000 mL（用三乙胺和冰乙酸调节pH值至3.4）；B液:甲醇。

1.5.2提取液的配制50 mg EDTA+25 mL冰乙酸+5 mL三乙胺用去离子水,，定容至1000 mL。

1.5.3标准工作液的配制称取0.0095 g维生素B2标准品置于100 mL的容量瓶中，加入1 mL冰乙酸在沸水浴（80～100℃）中煮沸30 min，待其自然冷却到室温后用去离子水定容至刻度配制成标准储备液。取2.5 mL维生素B2标准储备液于50 mL的棕色容量瓶中，用一定比例的流动相A液和B液定容至刻度后置于冰箱中待用。

2　试验方法

2.1国标法测定的色谱条件GB/T14701-2002标注的色谱柱:NoVa-pakC18（3.9 mm×150 mm，4-Microm）。

实验用色谱柱:ZORBAX SB-C18（4.6 mm× 150 mm，5-Microm）。流动相:A液与B液按照86∶14的配比混合。流速:0.8 mL/min。进样量:10 μL。柱温:25～28℃。检测波长:267 nm。

2.2优化法测定的色谱条件色谱柱:ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5-Microm）。流动相:A液与B液按照85∶15的配比混合。流速:1 mL/min。进样量:5 μL。柱温:35℃。检测波长:265 nm。

3　结果

3.1标准品测定结果

3.1.1国标法测定结果按照国标法的色谱条件测定维生素B2标准品溶液，同一浓度的标准溶液检测2次。在用国标法测定的过程中，因色谱柱的型号非国标的要求，国标GB/T 14701-2002上预计的保留时间为10 min，但在实际的实验过程中的出峰时间都约为70 min，出色谱峰需要的时间过长。其测定结果为保留时间:73 min；出峰时间: 69.715 min。色谱峰图如图1所示。

图1维生素B2标准品国标法测定色谱图

3.1.2优化法测定结果按照上述优化法的色谱条件测定维生素B2标准品溶液，同一浓度的标准溶液检测2次。其结果为保留时间:9.3 min；出峰时间:8.562 min；色谱峰图如图2所示。

图2维生素B2标准品优化法测定色谱图

3.2标准曲线与线性范围选取适当的移液管精密吸取配制好的标准储备液（100 μg/mL），用优化法的流动相稀释成浓度为1、5、12.5、25、50 μg/mL的系列标准工作液。在上述优化法的色谱条件下检测，每个浓度检测2次，进样的顺序为低浓度到高浓度。将两次测得的色谱峰峰面积求平均值，将平均峰值与对应工作液的浓度作图得到标准曲线，求其回归方程及相关系数。

回归方程为Y=25.123X+8.5728，相关系数R=0.999，表明在该方法下维生素B2在0～50 μg/mL浓度范围线性关系良好。

3.3样品测定结果将A、B两组饲料共四个试样溶液按照上述优化法的液相色谱条件进行测定，每个样品检测2次。根据测定得出的色谱峰图及具体信息可知所有的样品溶液都在8.5 min右检测出目标峰，并且所得到的色谱峰峰形较好。查标准曲线，计算得出了样品中维生素B2的含量，根据测定结果的数值计算其相对偏差，结果见表1。

表1试样含量测定结果

从上述结果可发现A组饲料所测得的相对偏差为±2.03%，B组饲料所测得的相对偏差为± 0.93%，在实验中所测得的两组饲料样品中维生素B2的含量都在10×103～1.00×103mg/kg，其相对偏差满足≤±10.0%，证明该优化法的重复性良好。

3.4精密度分别取饲料A和饲料B两组饲料的两个样品中任意一种饲料配制成样品溶液，按照上述优化法的条件在高效液相色谱仪中进行平行测定6次，得其峰谱图。测定含量及相对标准偏差值（RSD）见表2。

表2精密度测定结果

精密度试验在A、B两组样品溶液中所得的RSD分别为:1.02%，1.83%。都小于2%，在标准范围内，这说明该试验中的色谱仪精密度良好。

4　分析与讨论

4.1样品前处理饲料样品的前处理程度可在很大的程度上影响样品的测定结果。郭亚冬等（2004）认为维生素B2的水溶性较差，在水中的溶解度较小，因此在前处理过程中应适当加入少量酸、碱或在水浴上加热使其完全溶解。维生素B2对光辐射敏感特别是紫外线，对其进行光照及紫外线照射时易发生不可逆的分解反应，因此在实验操作过程中尽量使用棕色容量瓶，并将配制好的维生素B2标准液、工作液放置在避光的环境中。

4.2色谱条件

4.2.1波长的选择采用高效液相色谱法检测，不同的试样出现特征性的色谱峰所需要的检测波长是不同的。梁琳等（2016）将烟酰胺、维生素B6、维生素B1和维生素B2的标准溶液分别进行扫描200～400 nm的吸收谱线，得出维生素B2的最大吸收波长为268 nm。国标（GB/T14701-2002）中表明采用紫外检测器测定维生素时，多种维生素联检时的波长选择为280 nm，单一检测维生素B2时的波长选择为267 nm。根据国标上的要求，在实际的检测当中，优化法所选取的测定波长是265 nm，此波长维生素B2有较大吸收。

4.2.2流动相的选择王琛等（2010）认为流动相的选择对优化液相色谱的条件有很大的影响，若流动相的pH值改变，维生素B2出峰的位置将会发生明显的变化，同时也将会影响维生素B2的分离度。根据维生素B2的特性，在稀酸溶液中较稳定，本实验将流动项的pH调为3.4时维生素B2的分离度较好。

4.2.3甲醇对试验结果的影响索德成等（2015）研究表明，甲醇含量的变化对测定维生素B2的保留时间有比较明显的影响，测定维生素B2的保留时间将会随着流动相中甲醇浓度的降低而延长，而且在得到的色谱峰图中会出现明显的拖尾现象，导致峰的基线不平稳，对称性较差等。本实验优化法甲醇在流动相中的比例为15%，与国标法相似。

4.3国标法与优化法的比较按照国标测定饲料中维生素B2的结果显示:A、B两组饲料中都没有检测出维生素B2的色谱峰图，对于维生素B2的标准品，国标法能检测出其峰谱图，且其峰型良好，基线平稳，但所耗用的时间较长。采用优化法检测维生素B2的实验中，维生素B2的标准品也能得到较好的色谱峰图，与国标法所得到的色谱峰图比较，峰形较差，但是出峰的时间较短，仅需9 min。并且用优化法检测试样液中维生素B2的实验结果表明，A、B两组饲料中的四个样品能够在相应的保留时间内得到很好的色谱峰图。从实验所得的整个结果来看，优化法比国标法具有更高的灵敏度，更有利于实际操作。

4.4影响测定结果的其他因素索德成等（2015）认为，复合预混饲料中存在大量的金属离子，在处理样品的过程中，加入EDTA可作为金属离子的掩蔽剂，能够有效地消除金属离子对出峰时间、峰的对称性、基线的平稳度等干扰，从而提高检测结果的准确性。

5　结论

本实验采用了两种不同的色谱条件来检测饲料中维生素B2的含量，不同的色谱条件下检测试样得到的峰不同。就本实验中的两种色谱条件来说，国标法的出峰时间为70 min，峰型较好，基线平稳；优化法的出峰时间为9 min，峰型较国标法差，基线不如国标法的平稳，但用优化法检测时出峰的时间更短，具有更快的检测速度和更高的灵敏度。这表明在没有国标法要求的色谱柱的条件下，本实验中所用优化法可作为快速、可行的测定饲料中维生素B2含量的方法。

[1]王晴.高效液相色谱法测定饲料中维生素B2[J].黑龙江畜牧兽医，2000，7∶14～15.

[2]郭亚东，马银海，李燕华，等.维生素B1、B2含量测定方法比较[J].食品科学，2004，25（6）∶153～156.

[3]梁琳，王英.HPLC法同时测定维生素预混合饲料中5种B族维生素[J].中国饲料，2016，1∶21～23.

[4]王琛，陈彬彬，邹梅娟，等.HPLC法同时测定多维元素胶囊中烟酰胺，维生素B6，维生素B1和维生素B2的含量[J].海峡药学，2010，22（3）∶52～55.

[5]索德成，赵小阳，李兰.高效液相色谱法同时测定预混合饲料中维生素C、维生素B2及其磷酸盐[J].中国饲料，2015，2∶34～37.■

DOI∶10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20162010

In this experiment，the content of vitamin B2in feed was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.Two methods of national standard method and optimization method were adopted.The national standard method:according to GB/T 14701-2002.Optimization method:using high performance liquid chromatograph Agilent-1260，ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5-Microm）chromatographic column；mobile phase for A liquid:1000 mL contained 1.1003 g heptane sulfonic acid sodium，0.0502 g EDTA and 25 mL ice acetic acid，5 mL triethylamine solution，with ice acetic acid and triethylamine to adjust pH value of 3.4；B liquid methanol；A∶B（85∶15）；detection wavelength of 265 nm；column temperature 35℃；the flow rate and sample volume:1.0 mL/min，0.5 μL.Results showed that the retention time of national standard method for 70 minutes，optimization method of retention time was about 9 minutes，and the correlation coefficient，repeatability and precision of optimization method meet the requirements.The results indicated that the required time of optimization was shorter，more had the advantages of fast and accurate determination.

high performance liquid chromatography；Vitamin B2；chromatographic condition optimization

S816.17

A

1004-3314（2016）20-0038-03