枯草芽孢杆菌发酵复方中草药工艺优化

武洪志，宋玉卓，王志龙，郭照宙，许灵敏，王芳芳，刁华杰，许丽，刁新平

（东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨150030）

枯草芽孢杆菌发酵复方中草药工艺优化

武洪志，宋玉卓，王志龙，郭照宙，许灵敏，王芳芳，刁华杰，许丽，刁新平*

（东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨150030）

为研究枯草芽孢杆菌发酵复方中草药饲料添加剂的最佳工艺，通过单因素和响应面相结合的试验方法对枯草芽孢杆菌发酵复方中草药生产工艺进行优化。选用枯草芽孢杆菌对复方中草药进行发酵，以复方中草药多糖含量为检测指标，在接菌量、含水量、发酵时间和发酵温度4个单因素的基础上，选择对发酵效果影响较大的关键因素进行响应面试验来进一步优化。结果表明∶4个单因素中，含水量、接菌量和发酵时间对发酵效果影响较大，为关键因素，经响应面法进一步优化后得出最佳条件为含水量为51.50%，接种量为3.60%，发酵时间为2.7 d，此条件下测得复方中草药多糖含量平均值为19.59%，与响应面预测值19.78%接近，相较于未发酵复方中草药中12.70%的复方中草药多糖，发酵后复方中草药多糖含量提高了55.75%。

饲料添加剂；复方中草药；发酵；工艺优化

中草药早已以添加剂的形式应用于畜牧生产中，但其炮制过程仍以熬制为主，这极大程度限制了其推广应用。中草药经发酵后其有效成分得到极大程度的释放，药效也达到最佳状态（李洪龙等，2007）。苍术、白术、黄柏、板蓝根、山楂、甘草等中草药均能不同程度提高动物机体的免疫力，且无毒副作用，也不存在残留问题（张鹏，2013）。本试验以上述几种中草药为配伍，用枯草芽孢杆菌对其进行发酵，使其有效成分得到最大程度的释放，为其在饲料中的应用提供依据。

1　材料与方法

1.1试验材料中草药:复方中草药中苍术、白术、黄柏、板蓝根、甘草、山楂等均购自哈尔滨三棵树中药材市场，65℃烘干，粉碎后过40目筛，备用。

供试菌种:枯草芽孢杆菌，购于智荟生物科技股份有限公司。

试验试剂:LB培养基、葡萄糖、乙醇、浓盐酸、蒽酮、浓硫酸等试剂均为分析纯，购于哈尔滨市德美实验仪器经销有限公司；酶联免疫试剂盒:免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG），购于R＆D公司；生化指标:总蛋白（TP）、总胆固醇（CHOL）、生长激素（GH），均由黑龙江电力医院检测。

试验仪器设备:制冰机（FM100，GRANT）、高速离心机（Allegra 64R）、美国BACKMAN全自动生化分析仪等均由东北农业大学动物营养实验室提供。

1.2试验方法

1.2.1中草药发酵前的预处理将中草药于65℃烘箱中烘干，粉碎后过40目筛，于紫外灯下灭菌，放置到超净工作台中备用。

1.2.2 LB培养基的配制本试验采用液体LB培养基。配制1 L培养基，需要在950 mL去离子水中加入10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g氯化钠，搅拌直至溶质完全溶解，之后用5 mol/L氢氧化钠调pH至7.0。用去离子水定容至1 L，然后121℃高压蒸汽灭菌20 min，放置到超净工作台中备用。

1.2.3枯草芽孢杆菌菌种活化在超净工作台中，用无菌水将枯草芽孢杆菌菌粉充分溶解，然后用移液枪准确吸取1 mL该菌溶液加入到装有99 mL液体LB培养基的三角瓶中，摇匀封口，于37℃电热恒温培养箱中培养48 h，连续培养两代，之后采用平板计数法检测枯草芽孢杆菌的数量，当达到109个/mL时，即视为达标。最后用接种环转接到装有100 mL液体LB培养基的三角瓶中，封口密封，于37℃电热恒温培养箱中培养48 h，备用。

1.2.4接种发酵准确称取粉碎烘干后的中草药粉末18份于250 mL三角瓶中，每份22.5 g，将适量无菌水加入到事先活化好的菌液中，摇匀，取出超净工作台中的中草药（发酵培养基），加入菌液，边加边搅拌。上述操作过程都在无菌环境中进行，并尽快完成。将接种后的中草药于恒温培养箱中发酵适当天数。

1.2.5复方中草药发酵工艺单因素试验设计本试验选取接菌量、含水量、发酵时间和发酵温度为单因素进行试验，将活化好的枯草芽孢杆菌接种到复方中草药中进行发酵，以复方中草药多糖含量为指标（兰时乐等，2010），试验因素和水平见表1。

1.2.6响应面优化发酵工艺

1.2.6.1对发酵效果影响较大因素的筛选利用SPSS 20.0对单因素试验数据进行分析，比较接菌量、含水量、发酵时间和发酵温度4个因素之间的差异，筛选出对发酵效果影响较大的因素。

表1试验因素和水平

1.2.6.2响应面对发酵条件的优化利用Design Exepert.V.8.0.6.根据Box-Behnken中心组合设计原理，采用响应面分析，建立复方中草药多糖含量与各关键因素的数学模型，来计算分析复方中草药的最佳发酵条件，从而确定对发酵效果影响较大因素的最佳水平组合。

1.2.6.3模型验证试验以优化后的最佳水平组合进行5次重复试验，对该模型的预测值进行验证，检验该模型的预测结果是否准确，通过对试验结果与模型预测结果的比较，进行可靠性分析，最终确定最优发酵条件组合。

1.3复方中草药多糖含量测定

1.3.1葡萄糖标准曲线的绘制准确称取105℃烘干至恒重的葡萄糖样品10 mg于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。精确量取该溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，分别置于干净的具塞试管中，加蒸馏水至1 mL，然后迅速加入4 mL新配制的蒽酮-浓硫酸溶液（准确称取0.1 g蒽酮，溶于100 mL 80%的浓硫酸），摇匀后于沸水浴中加热10 min，冷却至室温。以未加葡萄糖样品的溶液为参比，在625 nm处检测其吸光度。根据所测结果绘制出葡萄糖标准曲线得到回归方程:y=83.94x+0.012，R2=0.9987。

1.3.2样品液的制备与测定准确称取烘干至恒重的复方中草药样品0.5 g于150 mL三角瓶中，加入80%乙醇45 mL，静置30 min后超声提取30 min，于100 mL容量瓶中过滤，弃上清液，重复上述操作一次，蒸干滤渣后加入2%盐酸45 mL，沸水浴提取1 h，充分放冷，于100 mL容量瓶中滤过，重复操作一次，合并滤液后用2%盐酸定容至刻度，混匀，取1 mL于25 mL容量瓶中，用2%盐酸定容至刻度。取上述制备好的溶液1 mL于10 mL干燥洁净的试管中，加入新配制的蒽酮-浓硫酸溶液4 mL，混匀，沸水浴加热10 min，充分放冷，在625 nm处测量其吸光度。样品经紫外分光光度计测定后，以标准曲线为准，计算得出相应的多糖含量，并以如下

式中:W为发酵复方中草药多糖含量；C为标准曲线中相对应的糖的质量分数（mg/L）；V为发酵复方中草药试样稀释的总体积，L；M为发酵复方中草药样品的质量，g。

2　结果与分析

2.1复方中草药发酵工艺单因素试验

2.1.1含水量对发酵复方中草药多糖含量的影响由图1可见，当含水量在30%～80%时，复方中草药多糖含量呈先上升后降低的趋势，含水量在50%时，复方中草药多糖含量达到最大值，因此，选择含水量50%对其他因素进行筛选。公式计算出多糖得率:

图1含水量对发酵后多糖含量的影响

2.1.2接菌量对发酵后复方中草药多糖含量的影响由图2可见，当接菌量在2%～12%时，复方中草药多糖含量呈先上升后降低的趋势，接菌量在4%时，复方中草药多糖含量达到最大值，因此，选择接菌量4%，含水量50%对其他因素进行筛选。

图2接菌量对发酵后多糖含量的影响

2.1.3发酵时间对发酵后复方中草药多糖含量的影响由图3可见，当发酵时间为1～6 d时，复方中草药多糖含量呈先上升后降低的趋势，发酵时间为3 d时，复方中草药多糖含量达到最大值，因此，选择发酵时间3 d，接菌量4%，含水量50%对发酵温度进行筛选。

图3发酵时间对发酵后多糖含量的影响

2.1.4发酵温度对发酵后复方中草药多糖含量的影响由图4可见，当发酵温度为29～39℃时，复方中草药多糖含量呈先上升后降低的趋势，发酵温度为31℃时，复方中草药多糖含量达到最大值，因此，最佳发酵温度为31℃。

图4发酵温度对发酵后多糖含量的影响

2.2利用响应面法优化复方中草药发酵工艺

2.2.1筛选对发酵效果影响较大的因素统计4个因素的单因素试验数据，用SPSS 20.0软件对其结果进行方差分析，并比较4个因素之间的差异，结果见表2。通过对4个因素F值的比较可知，4个因素对发酵复方中草药多糖含量的影响强弱依次为:含水量、发酵时间、接菌量、发酵温度，因此选择对结果影响较大的含水量、发酵时间、接菌量3个因素进行响应面试验。

表2单因素试验结果方差分析

2.2.2响应面优化复方中草药发酵工艺根据Box-Behnken中心组合设计原理，选择含水量（A）、发酵时间（B）、接菌量（C）进行三因素三水平的响应面试验，以复方中草药多糖得率（Y）为响应值进行分析，结果如表3所示。

通过Design Expert.V.8.0.6.统计软件，Box-Behnken中心组合设计，试验设计及结果见表4。其中2、6、12、15、16组的含水量、发酵时间、接菌量分别为50%、3 d、4%，是中心试验组，其他试验组为析因试验组。

表3响应面因素水平及设计

表4 Box-Behnken试验设计及复方中草药多糖测定结果

其他发酵条件:发酵温度37℃。以复方中草药多糖含量为响应值，每个发酵试验重复3次。

2.2.3模型的建立及显著性检验对Box-Behnken试验结果进行方差分析，结果见表5。同时对模型进行可信度分析，结果见表6。

表5回归方程统计分析

用F值检验三元二次回归方程各部分对响应值（Y）的影响，由表5可知，该模型的回归项中P值＜0.0001，说明该模型高度显著（P＜0.0001）。失拟项P值为0.1868＞0.05，差异不显著（P＞0.05），说明该模型预测结果与实际结果较拟合。R2（回归模型决定系数）=0.9545，说明该模型能够解释发酵复方中草药多糖含量的95.45%，说明该模型比较可靠，能够对发酵复方中草药多糖含量进行预测。由表5可知，含水量的二次项A2对模型影响高度显著（P＜0.0001），发酵时间的二次项B2、接菌量的二次项C2对模型影响显著（P＜0.05），其他系数（含水量A、发酵时间B、接菌量C、AB、AC、BC）影响不显着（P＞0.05）。

对试验结果进行二次线性回归拟合，如表6所示。

表6方程回归系数估计

根据表6分析，得到三元二次回归方程:

Y=19.77+0.10A-0.094B-0.14C-5.00E-03AC-0.018BC-1.89A2-0.5B2-0.72C2

2.2.4各因素最佳水平分析对三元二次回归方程模型进行最优化分析，得到各因素的最佳水平，如表7所示。

由表7可知，当含水量为51.5%，发酵时间为2.7 d，接菌量为3.6%时预测复方中草药多糖含量最大值为19.78%，与未发酵复方中草药多糖含量12.70%相比，提高55.75%。

表7各因素的最佳水平分析

2.2.5 Box-Behnken响应面及等高线图结合三元二次回归方程，运用Design Exepert.V.8.0.6.软件，绘制两两因素的响应曲面图及等高线图，从中可以直观地看出两两因素的交互作用对发酵复方中草药多糖含量的影响，如图1、2、3所示。

图1含水量和发酵时间相互作用对复方中草药多糖含量影响的响应面和等高线图

图1、2、3可以直观地反应含水量、发酵时间和接菌量三因素及其相互作用对复方中草药多糖含量的影响。两两因素之间交互作用的强弱是由等高线的形状来反映的，椭圆形表示交互作用强，圆形表示交互作用弱（武洪志等，2016）。由图1和图2可以看出，响应面的坡度陡峭、等高线密集，表明含水量和发酵时间的交互作用及含水量与接菌量的交互作用对复方中草药多糖含量影响较强；由图3可知，发酵时间和接菌量的交互作用对复方中草药多糖含量影响较弱。

图2含水量和接菌量相互作用对复方中草药多糖含量影响的响应面和等高线图

图3发酵时间和接菌量相互作用对复方中草药多糖含量影响的响应面和等高线图

2.2.6模型验证试验在含水量51.5%，发酵时间为2.7 d，接菌量为3.6%，发酵温度为37℃的发酵条件下，分别进行5次验证试验。实测发酵复方中草药多糖平均值为19.59%，与预测值19.78%接近，进一步说明该数学模型能够较好地预测实际发酵情况。与未发酵复方中草药相比，多糖含量增加54.25%。

3　讨论

3.1枯草芽孢杆菌发酵复方中草药工艺优化目前，发酵是提高中草药多糖提取率最重要的方法之一，发酵过程中最关键的是对发酵条件的优化，最常用的分析方法有单因素试验、正交试验和响应面试验（Bandaru等，2006）。单因素试验是在假设各个因素之间没有交互作用的前提下，研究各个因素对试验结果的影响，因此分析结果比较片面，而正交试验与单因素试验相比能够分析部分因素之间的线性关系，但其试验结果只能是试验中某种组合，不会超越试验所选取水平范围，倘若因素过多，工作量会非常大。响应面分析方法具有试验次数少、周期短、回归方程精度高、能同时研究各因素间交互作用的特点，单因素试验和响应面试验结合后，单因素试验结果可以作为响应面设计因素和水平的依据，响应面可以弥补单因素试验的不足。

3.2单因素试验结果本次试验选择了含水量、接菌量、发酵时间和发酵温度4个单因素，测定其对发酵复方中草药多糖含量的影响。结果表明，接菌量是发酵过程中最重要的影响因素，不同水平的接菌量对发酵效果有不同的影响。朱秀清等（2012）在微生物发酵高温豆粕的菌种筛选及发酵工艺优化的研究中发现，高温豆粕的水解度随接种量的增加呈先上升后下降的趋势，与本试验中随着接菌量的增加多糖含量也呈现先上升后下降的趋势一致，因此，适宜的接菌量是保证发酵效果的前提；含水量是发酵过程中的重要参数，含水量的高低直接影响发酵的品质，王鹏等（2006）研究含水量对狗尾草发酵品质影响的结果表明，在适宜的含水量条件下，各处理组的发酵品质均为优或良，因此，适宜的含水量是保证发酵效果的必要条件。发酵时间是发酵工艺中不可缺少的因素，由微生物生长曲线可知，其最佳生长时期是对数期和稳定期，因此，适宜的发酵时间是发酵效果的重要保障。

3.3响应面优化发酵工艺响应面法本质上是一种统计方法，由于单因素中选择了四个对发酵效果有影响的因素进行试验，所以需要先做一个筛选试验，去掉对发酵效果影响不大的因素，本试验中发酵温度对发酵效果影响最小，因此剔除发酵温度因素。之后要确定当前发酵条件水平是否接近响应面的最优位置，当远离时，采用响应面一阶逼近；接近时，获得对响应面在最优值附近某个小范围内的一个精确逼近并识别出最优发酵条件，最后采用二阶设计，即Box-Behnken中心组合设计确定最优点，从而确定最优发酵条件。本试验选取含水量、发酵时间和接菌量三个因素建立响应面模型，通过模型回归分析和可信度分析确定本试验所得模型合理，能够对最佳发酵条件进行预测，并求数学模型的一阶偏导得到优化的发酵条件:含水量为51.5%，发酵时间为2.7 d，接菌量为3.6%。在此条件下，模型预测发酵复方中草药多糖含量最大值为19.78%，通过试验验证测得实际值为19.59%，两个结果相差不大，进一步说明本试验模型有效。武洪志等（2016）在黑曲霉发酵茯苓工艺优化的研究中，用单因素加响应面的试验设计，对发酵工艺进行优化，最终测得茯苓多糖含量和模型预测值相差不大，与本试验结果一致。

4　结论

利用单因素试验和三因素三水平响应面试验，确定枯草芽孢杆菌发酵复方中草药（苍术、白术、黄柏、板蓝根、甘草和山楂）的最佳发酵工艺为含水量51.5%，发酵时间2.7 d，接菌量3.6%。此工艺下测得复方中草药多糖含量为19.59%，与响应面预测值19.78%接近，相较于未发酵复方中草药多糖含量12.70%提高了55.75%。

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DOI∶10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20162007

The aim of this experiment was to study the optimum process of compound Chinese herbal medicine fermented by Bacillus subtilis.The compound Chinese herbal medicine process fermented by Bacillus subtilis was optimized through test method combining single factor and response surface.Using Bacillus subtilis fermented compound Chinese herbal medicine，and selected key factors which had greater impact on ferment from inoculation quantity，water content，fermentation time and fermentation temperature and for further optimization by response surface，with compound Chinese herbal medicine polysaccharide content as detection index.The results showed that water content，inoculation and fermentation time were the key factors in the four single factors，after further optimized by response surface the water content was 51.50%，inoculum was 3.60%，fermentation time was 2.7 days，and in this optimized condition the average value compound Chinese herbal medicine polysaccharide content was 19.59%，closed to predicted value 19.78%，and increased by 55.75%，compared with the compound Chinese herbal medicine polysaccharide content 12.70%in unfermented compound Chinese herbal medicine.

feed additive；compound Chinese herbal medicine；fermentation；process optimization

S816.3

A

1004-3314（2016）20-0026-06

国家科技支撑计划（2014BAD13B03-1）