维生素E琥珀酸酯处理人胃癌细胞过程中自噬与活性氧蓄积的交互作用

徐培翔，侯丽颖，宋华翠，余洋，吴坤*

（哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，黑龙江 哈尔滨 150081）

维生素E琥珀酸酯处理人胃癌细胞过程中自噬与活性氧蓄积的交互作用

徐培翔，侯丽颖，宋华翠，余洋，吴坤*

（哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，黑龙江 哈尔滨 150081）

维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然维生素E的衍生物中抑制肿瘤活性最强的一种[1]。国内外研究表明，VES具有抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，而对正常的组织细胞却无任何毒副作用[2]。本课题组前期研究也发现，VES对人胃癌SGC-7901细胞有抑制生长、促进分化和诱导凋亡的作用[3]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一类活性含氧化合物的总称，主要由线粒体产生，是指机体内有氧代谢过程中产生的活性产物。如果细胞内的抗氧化物质不能有效降解ROS，就会使ROS在细胞内蓄积从而引起氧化应激[4]。蓄积的ROS会氧化损伤胞内的DNA、蛋白、脂质及细胞器，从而导致细胞发生代谢紊乱[5]。

自噬(autophagy)是一种广泛存在于真核细胞内的溶酶体依赖性降解途径，是细胞进行自我保护的重要机制，在维持细胞存活、更新、物质再利用和稳定内环境中起到关键作用[6]。本课题组前期研究已经发现，VES可以诱导人胃癌细胞发生自噬并且导致细胞内ROS的蓄积[7-8]，但两者之间是否存在交互作用尚不清楚。本研究中我们用VES处理胃癌SGC-7901细胞，观察自噬与ROS的变化以及分别淬灭ROS与阻断自噬关键基因BECN-1后再观察两者的变化，旨在探讨VES在胃癌细胞中引起的自噬和ROS蓄积之间是否存在交互作用，为进一步阐明VES抑制肿瘤细胞生长的机制及探讨肿瘤治疗的新方案提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

人胃癌SGC-7901细胞由哈尔滨医科大学营养与食品卫生学教研室提供；VES、雷帕霉素(rapamycin，RAPA)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine， NAC)均购自美国Sigma公司，RPMI-1640培养液购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，微管相关蛋白l轻链3(microtubules associated protein 1 light chain 3，LC3)、Beclin-1抗体均购自Cell Signaling公司。β-actin抗体购自Santa Cruz公司。碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG以及罗丹明标记山羊抗兔二抗购于中杉金桥公司。BCA试剂盒、ROS试剂盒购于碧云天公司。

1.2 细胞培养与分组

SGC-7901细胞常规培养在37℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中，取对数增长期细胞用于试验。VES溶于无水乙醇中，配制成10mg/mL的储备液，4℃避光保存，备用。使用时用含2%胎牛血清的RPMI-1640培养液将VES储备液稀释至所需终浓度，浓度为0.1%的乙醇作为对照组，ROS淬灭剂NAC溶于去离子水。试验设不同剂量VES(0、5、10、15、20μg/mL)处理24h组，100 nmol/L RAPA阳性对照组，另外还设计了VES+NAC组(用20mmol/L NAC预处理2h)以及VES+ BECN-1 siRNA组(阻断BECN-1基因24h之后再用20μg/mL VES处理24h)。

1.3 免疫荧光染色观察LC3在细胞内的表达和分布

将对数生长期的细胞按2×105/mL的密度接种至6孔板中，置于37℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度的培养箱中培养。当细胞汇合率达到70%～80%时，给予不同浓度(0、5、10、15、20μg/mL)VES处理24h，并设阳性对照组(100 nmol/L RAPA)。4%甲醛固定30min，PBS冲洗3次，0.5% Triton X-100透膜，37℃温育5min，PBS冲洗3次，1% BSA封闭30min，加入LC3抗体(1∶200)，4℃过夜。1% BSA冲洗3次，加入罗丹明标记的山羊抗兔二抗，37℃温育1h，PBS冲洗3次，加入DAPI染料，使其终浓度为5μg/mL，37℃孵育15min，PBS冲洗3次，封片，采用激光共聚焦显微镜观察。

1.4 Western blot检测蛋白表达

收集不同处理组的胃癌细胞，用PBS冲洗3次，收集于EP管中，弃掉上清液并将细胞悬浮于裂解液中，超声破碎细胞，冰上裂解30min后，4℃，15 000 r/min离心10min，提取细胞总蛋白。取上清，采用BCA法测定上清液中蛋白质含量，并取等量蛋白上样，经SDS-PAGE凝胶电泳后，低温转移至PVDF膜，封闭，分别加入相应一抗和二抗，经显色，用数字成像仪对图像进行拍照和分析。

1.5 流式细胞术检测细胞内ROS含量的变化

收集不同处理组的胃癌细胞至EP管中，3 000 r/min离心5min，用PBS冲洗3次，ROS检测探针DCFHDA用无血清培养液按照1∶1 000 稀释，37℃孵育20min，用无血清培养液洗涤细胞3次以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，加少量PBS稀释，用滤网过滤到上样管中，通过流式细胞仪检测细胞内ROS含量。

1.6 RNA瞬时干扰阻断自噬关键基因BECN-1的表达

将对数生长期的细胞按2×105/mL的密度接种至6孔板中，37℃、CO2体积分数为5%的条件下温育过

夜。待细胞密度达到30%～50%时，按照HiperFect转染试剂说明书进行操作。将2.5μL siRNA稀释于100μL无血清培养基中(siRNA的最终工作浓度为5 nmol/L)。加入3μLhiperFect转染试剂，漩涡震荡混匀，室温孵育10min 以形成转染复合物，将转染复合物滴入细胞，轻晃培养板使其混匀，以常规条件培养带有转染复合物的细胞，6h后换含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，24h后用终浓度20μg/mL的VES处理24h，同时设置单纯BECN-1 siRNA干扰细胞24h组，通过流式细胞仪检测细胞内ROS水平。

1.7 Real-time PCR检测细胞内BECN-1m RNA表达

用Trizol法提取细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，采用SYBR Green进行Real-time PCR反应。反应参数：95℃、10min，1个循环；95℃、15 s，60℃、60 s，40个循环，样本中目的基因表达的计算方法为2-ΔΔCT。各基因引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物序列和产物长度

1.8 统计学方法-

2 结果

2.1 VES诱导SGC-7901细胞发生自噬

结果如图1。图中对照组未观察到明显的LC3点状分布情况，随着VES剂量的增加，LC3荧光强度增强，点状聚集逐渐增多，20μg/mL VES组能观察到明显聚集的LC3点状荧光，呈现剂量依赖性。随后检测细胞内自噬标志蛋白LC3和Beclin-1的表达结果如图2，与对照组相比，随着VES剂量的增加，Beclin-1蛋白的表达逐渐增强，LC3蛋白表达增强，同时LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例也呈上升趋势，呈现剂量依赖性(P< 0.05)，该结果提示VES可诱导人胃癌SGC-7901细胞发生自噬。

图1 免疫荧光染色观察不同浓度VES处理SGC-7901细胞24h后LC3的荧光强度(×400)

图2 VES诱导人胃癌SGC-7901细胞发生自噬后LC3和Bedclin-1蛋白的表达

2.2 VES诱导人胃癌SGC-7901细胞发生ROS蓄积

流式细胞术定量检测细胞内ROS含量，结果如图3所示。随着VES剂量增加，细胞内ROS含量逐渐升高，用NAC预处理细胞后，发现细胞内ROS含量与20μg/mL VES组相比明显下降(P<0.05)(图3A和3B)。提示VES可显著提高胃癌细胞内ROS水平，同时NAC可有效降低细胞内的ROS水平。

图3 VES诱导胃癌细胞内ROS蓄积

2.3 淬灭细胞内ROS后对细胞自噬的影响

VES处理前2h用20mmol/L NAC淬灭细胞内ROS，再以20μg/mL的VES处理细胞24h，试验分为对照组、

NAC组、VES组、VES+NAC组共4组。共聚焦显微镜观察细胞内LC3荧光强度及分布情况，结果如图4A所示，与对照组相比，NAC组LC3的荧光强度和分布无明显变化，而20μg/mL VES组LC3的荧光强度和点状聚集显著增强，VES+NAC组LC3的荧光强度和点状聚集明显弱于单独VES处理组。Western blot检测自噬标志蛋白Beclin-1及LC3蛋白表达，结果如图4B所示，与对照组相比，NAC组的Beclin-1及LC3蛋白表达无明显差异，而20μg/mL VES组能明显上调Beclin-1及LC3蛋白表达，VES+NAC组的Beclin-1及LC3蛋白表达低于单独VES处理组，表明细胞内ROS水平降低后，其自噬水平也随之降低。

图4 淬灭细胞内ROS后对细胞自噬的影响

2.4 RNA瞬时干扰阻断自噬关键基因BECN-1的表达后对自噬的影响

运用RNAi技术瞬时阻断自噬关键基因BECN-1。Real-time PCR检测细胞内BECN-1mRNA表达水平，结果如图5A所示，与VES单独处理组相比，BECN-1 siRNA转染后，细胞内BECN-1mRNA水平显著下降(P<0.05)。提示BECN-1 siRNA有效的阻断了BECN-1基因的表达。随后Western blot检测自噬标志蛋白Beclin-1表达，结果如图5B，BECN-1 siRNA转染后，细胞内Beclin-1表达与VES单独处理组相比明显下降，提示BECN-1 siRNA转染后细胞内自噬水平受到了抑制。

图5 RNA瞬时干扰阻断自噬关键基因BECN-1的表达后对自噬的影响

2.5 抑制自噬后检测细胞内ROS水平

试验分为对照组、BECN-1 siRNA组、VES组、VES+BECN-1 siRNA组共4组。流式细胞仪定量检测细胞内ROS水平，结果如图6所示，与对照组相比，BECN-1 siRNA组的ROS含量无明显变化，而20μg/mL VES组ROS含量明显上升，VES+BECN-1 siRNA组的ROS含量明显高于单独VES处理组(P<0.05)(图6)。结果表明，抑制自噬后，细胞内ROS蓄积增强，提示自噬可能参与了细胞内ROS的清除过程。

图6 抑制自噬后细胞内ROS蓄积增强

3 讨 论

自噬是生物体通过溶酶体或囊泡降解胞内成分的总称，不但在细胞的分化和成熟过程中起重要作用，而且在应对各种应激时也发挥着关键作用[9]。随着酵母模型的建立和基因技术的发展，人们对自噬分子机制和形态特点的了解才逐渐深入，并认识到自噬与人类的多种疾病，尤其是恶性肿瘤存在密切关系。通过

对自噬作用的研究，可进一步揭示肿瘤发生、发展的潜在机制，为肿瘤的预防和治疗提供新的思路。

调节细胞自噬的因素目前发现有很多种，包括饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白

质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等。另外，近年来，ROS诱导的线粒体氧化损伤在肿瘤细胞自噬的研究中越来越受到关注。本课题组前期研究结果已证实，VES可诱导人胃癌SGC-7901细胞发生由ROS蓄积导致的氧化应激及进一步发生凋亡，又有相关研究表明ROS可通过一系列途径上调细胞自噬[10]，故提示我们，在VES处理人胃癌SGC-7901细胞过程中，自噬有可能与氧化应激存在某种联系，基于上述假设而产生了本研究思路。

Beclin-1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳动物中调控自噬的特异性基因，在自噬泡形成过程中起关键作用。LC3分为胞质型的LC3-Ⅰ及膜结合型的LC3-Ⅱ，当自噬发生时，自噬体形成增多，不仅仅表现为胞浆内LC3蛋白表达增加，同时，胞浆内的LC3-Ⅰ会转变为自噬体膜上的LC3-Ⅱ，使LC3-Ⅱ蛋白的比例增加，提示细胞自噬的发生。本研究结果显示，不同浓度VES作用于人胃癌SGC-7901细胞后，随着VES剂量的增加，用激光共聚焦显微镜观察到细胞内LC3点状聚集逐渐增多和加强；Western blot结果显示，随着VES剂量的增加，Beclin-1蛋白表达逐渐增强，LC3蛋白表达增强，同时LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例也呈上升趋势，这些结果表明，VES能够诱导人胃癌SGC-7901细胞发生自噬。

一般情况下，细胞内的ROS处于较低水平，并不会对细胞造成过度损伤。但在一些不利的状态下，如剧烈的细胞内外环境变化以及各种疾病等，就使得ROS在细胞内蓄积从而引起氧化应激。NAC是一种巯醇化合物，作为细胞内还原型谷胱甘肽的前体，能促进谷胱甘肽合成，增强谷胱甘肽S转移酶(glutathione transferas，GST)的活性，直接作用于氧自由基并促进解毒，是一种强有力的抗氧化剂[11-12]。本研究结果显示，不同浓度VES作用于人胃癌SGC-7901细胞后，随着VES剂量的增加，流式细胞仪结果表明细胞内ROS水平逐渐增强，因此提示VES可诱导胃癌细胞发生ROS的蓄积。20mmol/L NAC预处理胃癌细胞2h能显著抑制ROS的产生，证实NAC具有清除ROS的作用。

目前相关研究表明，一些外源物质通过刺激细胞产生ROS，进而诱导细胞自噬。例如槟榔提取物和线粒体电子传递链抑制剂等能够引起肿瘤细胞中ROS水平升高，诱导自噬产生[13-14]；在坏死性小肠结肠炎疾病中，肿瘤坏死因子TNF-α可以造成线粒体功能异常，进而产生大量ROS，诱导线粒体自噬的产生[15-16]。本研究中，我们在VES处理前2h用20mmol/L NAC淬灭细胞内ROS后，比较不同处理组间LC3的荧光强度及Beclin-1和LC3蛋白表达情况，结果显示，与对照组相比，NAC组LC3的荧光强度、Beclin-1及LC3蛋白表达均无明显变化，而20μg/mL VES组的荧光强度显著增强并能明显上调Beclin-1及LC3蛋白表达，VES+NAC组的LC3荧光强度、Beclin-1及LC3蛋白表达均明显低于VES单独处理组，提示ROS的蓄积有可能诱导自噬

的发生。

目前较为普遍的观点是，如果体内固有的ROS系统发生异常，致使ROS 蓄积，那么机体会补偿性地提高自噬水平来降解ROS。例如，在自噬相关基因突变的酵母菌细胞内ROS水平会比野生型酵母菌株的高[17]。本研究中，我们阻断自噬起始关键基因BECN-1表达后，流式细胞术结果显示，与对照组相比，BECN-1 siRNA组的ROS水平无明显变化，而20μg/mL VES组ROS水平显著增强，VES+BECN-1 siRNA组的ROS水平明显高于单独VES处理组，因此提示，自噬有可能减轻了细胞内ROS的蓄积。

综上所述，VES在诱导人胃癌SGC-7901细胞发生ROS蓄积的同时，也诱导了自噬，当淬灭胞内ROS时，细胞内的自噬水平会降低，说明ROS是自噬的诱导因素之一。当干扰阻断自噬起始关键基因BECN-1时，细胞内ROS水平上升，提示自噬可以缓解ROS的蓄积。值得注意的是，虽然VES诱导的自噬参与了细胞内ROS的清除过程，但是并未从根本上扭转细胞内ROS升高的最终结果，说明VES诱导的自噬并不足以完全清除VES诱导的ROS，只能缓解部分ROS的胞内蓄积。本研究阐明了VES处理人胃癌细胞过程中自噬与ROS水平可以相互调节，具有交互作用。这将对胃癌的临床治疗提供新的思路。

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Inductionof autophagy and reactive oxygen by vitamin E succinate inhuman gastric carcinoma cells

XU Peixiang，HOU Liying，SONGhuacui，YU Yang，WU Kun*
(Departmentof Nutrition and Foodhygiene, School of Publichealth,harbinmedical University,harbin 150081,heilongjiang, China)

目的： 探讨维生素E琥珀酸酯(VES)处理人胃癌SGC-7901细胞过程中自噬与活性氧(ROS)蓄积是否存在交互作用。方法：不同剂量(0、5、10、15、20μg/mL)VES处理人胃癌SGC-7901细胞24h，采用免疫荧光染色观察细胞内自噬标志蛋白微管相关蛋白l轻链3(LC3)的荧光强度和分布情况，Western blot检测自噬标志蛋白LC3和Beclin-1的表达情况，流式细胞术检测细胞内ROS水平；用ROS淬灭剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理2h后以20μg/mL VES处理人胃癌SGC-7901细胞24h，免疫荧光染色观察细胞内LC3荧光强度和分布情况，Western blot检测LC3和Beclin-1的表达情况；RNA瞬时干扰阻断BECN-1基因的表达后，以20μg/mL VES处理人胃癌SGC-7901细胞24h，流式细胞术检测细胞内ROS水平。结果：与对照组相比，随着VES作用剂量的增加，LC3的荧光强度逐渐增强；LC3和Beclin-1蛋白表达均逐渐升高；流式细胞术检测结果显示胞内ROS水平逐渐增强；淬灭ROS之后LC3荧光强度以及LC3和Beclin-1蛋白表达水平均明显低于VES单独处理组(P<0.05)；阻断自噬关键基因BECN-1后细胞内ROS水平高于VES单独处理组(P<0.05)。结论：VES可诱导人胃癌细胞发生自噬及ROS蓄积，并且VES处理人胃癌细胞过程中自噬与ROS水平可以相互调节，具有交互作用。

维生素E琥珀酸酯；胃癌细胞；自噬；活性氧

OBJECTIVE:To investigate the expressionof autophagy and accumulationof reactive oxygen species (ROS) afterhuman gastric cancer SGC-7901 cells were treated with vitamin E succinate (VES).METHODS：Human gastric cancer SGC-7901 cells were treated with VES at different doses (0，5，10，15，20μg/mL) for 24h.Then，laser confocalmicroscopy was used to observe fluorescence intensity and distributionof the autophagymarker protein：microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3).Western blot was used to evaluate the expression levels of LC3 and Beclin-1.Flow cytometry was used to detect the level of intracellular ROS.In addition，cells exposed to 20μg/mL VES for 24h with or withoutantioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC，20mmol/L)，were observed for fluorescence intensity and distributionof LC3.Western blot was used to evaluate levels of LC3 and Beclin-1.Furthermore，cells with BECN-1 knocked-down by RNA interference were treated with 20μg/mL VES for 24h.Then，flow cytometry was used to detect the level of intracellular ROS.RESULTS：Compared with the control group，VES treatment increased the amountof intracellular LC3 punctate fluorescence and the numberof autophagic vacuoles，and increased the expressionof endogenous autophagymarker protein LC3 and Beclin-1.Flow cytometry showed that the level of intracellular ROS was gradually increased.When ROS production was reduced by the antioxidant NAC，the fluorescence intensity of LC3，the expressionof LC3 and Beclin-1 were significantly lower compared with VES-treatmentalone.After the cells were transfected with BECN-1 siRNA，the level of intracellular ROS washigher compared with VES alone.CONCLUSION：VEsinduced autophagy and accumulationof ROsinhuman gastric cancer SGC-7901 cells.In addition，there were

vitamin E succinate；gastric cancer cells；autophagy；reactive oxygen species

R730.2

A

1004-616X(2016)06-0413-07

10.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.001

2016-05-05；

2016-06-27

国家自然科学基金项目(81172651)

作者信息： 徐培翔，E-mail：xupeixiang1234@126.com。*通信作者，吴坤，E-mail：wukun_15000@126.com

interactions between autophagy and ROS level in VES-treated cells.