黄连解毒汤的体外抑菌试验及拆方研究

王 维，李 丹，刘 洋，李俊姣，范 萌，师琦鹏，杨国栋

(河南科技大学，河南洛阳 471003)



黄连解毒汤的体外抑菌试验及拆方研究

王 维，李 丹，刘 洋，李俊姣，范 萌，师琦鹏，杨国栋*

(河南科技大学，河南洛阳 471003)

为了研究黄连解毒汤的体外抑菌效果，本试验采用平板打孔法和试管二倍稀释法研究黄连解毒汤对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌的体外抑菌作用。平板打孔法试验结果表明,黄连解毒汤对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌的抑菌圈直径依次为7.50 mm±0.50 mm、14.00 mm±0.80 mm、10.63 mm±0.89 mm。试管二倍稀释法试验结果表明,黄连解毒汤对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌最小抑菌质量浓度(MIC)依次为250.0、31.25、250.0 g/L；最小杀菌质量浓度(MBC)依次为500.0、250.0、250.0 g/L。对黄连解毒汤进行拆方试验研究结果表明，黄芩单味药对金黄色葡萄球菌的抑菌效果与黄连解毒汤原方的抑菌效果相接近，黄芩是原方中发挥抑菌作用的主药。黄芩、黄连两药配伍有拮抗作用，使其抑菌作用减弱。本研究为兽医临床上用中药方剂防治细菌性疾病提供理了论依据。

黄连解毒汤；体外抑菌；拆方

根据2012年美国《科学》杂志报道，中国是世界上最大的抗生素生产和消费国，中国抗生素原料的年产量约21万吨，其中有9.7万吨用于畜牧养殖业，占年总产量的46.2%[1]。抗生素在预防、治疗畜禽疾病等方面发挥着积极作用，同时在生物体和环境中残留所引起的负面效应也日益增大。抗生素的滥用产生了“耐药菌”。多重耐药菌的出现导致抗菌药在兽医临床上疗效减弱或消失，畜禽病程延长，并引起相应的并发症，给畜牧业生产带来巨大的经济损失[2-4]。与抗生素相比，细菌对抗感染中药及其复方不易产生耐药性，且部分中药具有延缓、消除、逆转细菌耐药性的作用[5]。因此，开展中药复方的抗菌作用研究对于保障畜禽健康养殖、可持续地发展具有重要意义。本试验以临床上常用于治疗细菌性感染的方剂黄连解毒汤为研究对象，研究其对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌的体外抑菌作用，以期为兽医临床上用中药方剂防治细菌性疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材和主要试剂 黄连解毒汤方剂组成：黄连9 g，黄芩6 g，黄柏6 g，栀子9 g， 所用药材均买自北京同仁堂饮片有限公司洛阳分店。蛋白胨、酵母膏(批号：20130620、20130323)，北京双旋微生物培养基制品厂产品；牛肉粉、酸水解酪蛋白(批号：20151104、1108B0314)，Solarbio公司产品；营养琼脂(批号：20130208)，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；可溶性淀粉(批号：20150406)，天津市风船化学试剂科技有限公司产品；氯化钡(批号：1311101)，西陇化工股份有限公司产品。

1.1.2 主要仪器 SW-CJ-1F型超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；YXQ.SG41.280A型高压灭菌锅，上海寰熙医疗器械有限公司产品；HHA-12型电热恒温培养箱，上海喆钛机械制造有限公司产品；BSA124S-CW电子分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司产品。

1.1.3 试验菌种 大肠埃希菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门菌(Salmonella) 均由河南科技大学动物科技学院微生物实验室保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 中药及复方提取液的制备 采用水煎法制备中药提取液，按照黄连解毒汤的配方将购买好的中药用电子天平称取；将量取好的药剂加入清洗干净的煎药锅中，在煎药锅中加500 mL蒸馏水并侵泡30 min，武火加热至沸后，文火保持微沸30 min，用两层无菌纱布过滤，滤出煎液，放置到提前准备好的三角瓶中，随后将药渣二次水煮，合并滤液，过滤，调整药液浓度至含生药量1 g/mL，灭菌后低温保存。拆方试验中的其他中药提取液按上述同样的步骤进行。

1.2.2 供试菌液的制备 将保存在冰箱的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌分别接种于LB培养基中，摇床上以150 r/min、37℃摇24 h。取出后，用灭菌的生理盐水稀释，以0.5麦氏比浊管比浊，调其含菌量为1.5×108CFU/mL。然后用灭菌的生理盐水将菌种稀释1 000倍，使其含菌量为105CFU/mL～106CFU/mL备用[6]。

1.2.3 体外抑菌试验 抑菌试验采用琼脂平板打孔法，将制备好的MH琼脂培养基表面均匀涂布供试菌液，用直径6 mm的打孔器打孔，每个平皿打3孔，孔距>20 mm，将中药提取液灌注到孔中，每孔灌注中药提取液50 μL。将平皿放置到37 ℃恒温箱中培养18 h，观察试验结果，测量抑菌圈直径，取平均值，试验重复5次。

1.2.4 测定最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC) 采用试管2倍稀释法。试验共设4组，第1组试验取10支经过高压灭菌的试管，在第1～9管中均加入无菌的肉汤培养基2 mL，在第1个管中加入中药提取液2 mL，混匀后取2 mL加入第2管，以此类推，至第 9管取2 mL废去。第10个试管做阳性对照，即不加中药提取液，添加无菌的肉汤培养基2 mL。最后向10支试管中分别加入50 μL供试菌液并震荡使其均匀。第2组为阴性对照组，区别在于试管中不加供试菌液，其他和第1组相同。第3组，第4组为重复试验组，加样过程同第1组。将试管放置到恒温培养箱中，37 ℃培养18 h。阳性对照组出现细菌生长的浑浊现象，阴性对照组无细菌生长的浑浊现象出现，则试验成立，观察其他试管状况。不出现浑浊的浓度是该复方的最小抑菌质量浓度(MIC)。将所有清晰无菌生长的试管培养液以划线法接种于普通琼脂平板，37 ℃培养24 h，以菌落不超过5个为该药物最小杀菌质量浓度(MBC)[7]。

1.2.5 拆方试验 拆方试验是为进一步研究复方中各单味药的抗菌作用，以及某两个或几个单味药之间的相互作用，以期了解单味药的抗菌作用以及不同药之间是否存在协同作用。鉴于此，对黄连解毒汤方剂进行了拆方。复方组成以及方剂拆方设计见表1。根据排列组合对黄连解毒汤进行拆方，可分为15种新的组合分别为：组合1： 黄连9 g；组合2：黄芩6 g；组合3：黄柏6 g；组合4：栀子9 g；组合5：黄连9 g，黄芩6 g；组合6：黄连9 g，黄柏6 g；组合7：黄连9 g，栀子9 g；组合8：黄芩6 g，黄柏6 g；组合9：黄芩6 g，栀子9 g；组合10：黄柏6 g，栀子9 g；组合11：黄连9 g，黄芩6 g，黄柏6 g；组合12：黄连9 g，黄芩6 g，栀子9 g；组合13：黄连9 g，黄柏6 g，栀子9 g；组合14：栀子9 g，黄柏6 g，黄芩6 g；组合15：黄柏6 g，黄芩6 g，栀子9 g，黄连9 g。

表1 黄连解毒汤的拆方组合

注： 表中“+”表示组合中含有该种中药，表中“0”表示组合中不含有该种中药。

Note:"+"in table shows that this combination contains the traditional Chinese medicine, "0"in table shows that this combination does not contain the traditional Chinese medicine.

2 结果

2.1 黄连解毒汤的抑菌作用

利用平板打孔法，将培养皿在培养箱中培养18 h后，将其取出，观察培养皿上各个部分接种菌种的生长情况，在培养基表面距离打孔位置比较远的地方可以清晰的看到分布均匀，边缘整齐的菌落。而在打孔周围部分则出现大小不等的边界较为清晰的抑菌圈。黄连解毒汤对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌的抑菌圈直径依次为7.50 mm±0.50 mm、14.00 mm±0.80 mm、10.63 mm±0.89 mm，从试验结果来看金黄色葡萄球菌对黄连解毒汤有较高的敏感性，与大肠埃希菌、沙门菌相比差异极显著(P<0.01)。

2.2 最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度的测定

采用试管二倍稀释法，测定黄连解毒汤的MIC和MBC。试验结果显示黄连解毒汤对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌最小抑菌质量浓度(MIC)依次为250.0、31.25、250.0 g/L；最小杀菌质量浓度(MBC)依次为500.0、250.0、250.0 g/L。

2.3 黄连解毒汤的拆方试验

将新拆方出来的组合方剂对金黄色葡萄球菌再次进行体外抑菌试验，试验方法步骤与1.2.3中所述一致。试验测得黄连解毒汤原方(组合15)的抑菌圈直径为14.0 mm，其对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC为31.25 g/L和250.0 g/L；组合2的抑菌圈直径为13.83 mm，组合2对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为125.0 g/L和125.0 g/L。上述试验结果表明，单从对金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验效果来看，黄芩单味药的抑菌效果与黄连解毒汤原方的抑菌效果相接近，黄芩是原方中发挥抑菌作用的主药。此外，组合1的抑菌圈直径为9.63 mm，其对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC为125.0 g/L和250.0 g/L，这表明黄连单味药对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用，其他方剂抑菌效果不明显。15种组合对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小以及MIC、MBC数据见表2和表3。

表2 黄连解毒汤拆方组合对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径

注：小写字母不同表示差异显著(P<0.05);大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。

Note:Values with different small letters in the same column mean significant difference (P<0.05);and with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

3 讨论

3.1 关于中药的体外抑菌作用

数千年来，中兽医药在治疗各种动物疾病方面发挥着重要作用，特别是在防治疫疠及实热证等动物病证的实践过程中积累形成了一些有效的经典方药。而动物的疫疠及实热证多为现代兽医学中的感染性疾病[6]。现代药理实验证明，很多中药在抑菌方面效果明显，而其中清热解毒药的抗菌作用尤为突出[8-10]。黄连解毒汤首载于东晋名医葛洪编著的《肘后备急方》，但原书中给未出方名，直到唐代王焘的《外台秘要》才冠名为黄连解毒汤。该方由黄连、黄芩、黄柏、栀子4味中药按照3∶2∶2∶3的比例配伍组成，是清热解毒类方剂的代表方，具有清热、泻火、解毒的功效，主治实热火毒、三焦热盛之证。本试验研究了黄连解毒汤对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌的体外抑菌作用。结果表明黄连解毒汤对这3种细菌都有较明显的抑菌作用，尤其对金黄色葡萄球菌有显著的抑菌效果，这与其他学者的研究结果相一致[11]。

表3 黄连解毒汤拆方组合对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定结果

注：“-”表示在所设定的质量浓度范围内未测出该药的MIC和MBC。

Note:"-"in table shows that at the certain concentration range, the MIC or MBC were not detected.

3.2 黄连解毒汤抑菌试验的拆方研究

在临床上，中药的使用主要以复方的形式出现，一个中药复方由多种单味药构成，相互之间按照一定的比例配伍。相同的复方，由于各单味药之间的比例不同，其药效也会有很大的差异。中药方剂的配伍理论是祖国医学智慧的结晶。多年来，人们一直试图运用现代科学技术方法, 从现代医学的角度揭示其科学内涵。拆方是目前应用于中药复方组方理论研究的最为常用的方法[12]。本试验对黄连解毒汤对金黄色葡萄球菌的抑菌作用进行了拆方研究，从试验结果可以看出黄连解毒汤原方(组合15)的抑菌圈直径为14.0 mm，其对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC为31.25 g/L和250.0 g/L；组合2的抑菌圈直径为13.83 mm，其对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为125.0 g/L和125.0 g/L。即单从对金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验效果来看，黄芩单味药的抑菌效果与黄连解毒汤原方的抑菌效果相接近，黄芩是原方中发挥抑菌作用的主药。此外，黄连单味药对金黄色葡萄球菌也有明显的抑菌作用。组合3、组合4、组合10的试验结果显示，黄柏、栀子无论是单味药，还是两者的组合方剂在体外对金黄色葡萄球菌的抑菌作用都不明显。组合15、组合2、组合5、组合11、组合12的试验结果显示尽管黄芩、黄连单味药对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌效果，但是黄芩、黄连两者组合，黄芩、黄连与栀子或者黄柏组成的三味药的组合对金黄色葡萄球菌的抑菌作用都比较弱。据徐君等人报道黄芩、黄连配伍后，各成分生物利用度均降低。配伍后黄芩苷吸收速率减慢，同时吸收度降低[13]。冯瑾[14]等研究也出现类似的结果，黄芩黄连配伍使用，各成分生物利用度均不同程度降低。另据文献报道，黄连与黄芩共同煎煮可产生沉淀，沉淀物主要由黄连碱、小檗碱、表小檗碱、巴马汀、药根碱、黄芩甙和汉黄芩甙等组成。产生沉淀的原因是由于黄连中含有的原小檗碱型生物碱与黄芩中含有的多酚类化合物黄芩苷相互结合，生成分子量较大的水不溶物，而沉淀煎出液中黄连生物碱和黄芩中黄酮化合物的含量均有不同程度下降[15]。由此可见，黄芩、黄连两者组合对金黄色葡萄球菌的抑菌作用减弱可能是由于两种中药的化学成分在煎煮过程中形成沉淀造成的。本研究结果可为兽医临床上用黄连解毒汤防治动物细菌性疾病提供理论依据。

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InVitroAntibacterial Experiment of Huanglian Jiedu Decoction and Decomposed Recipes Experiment

WANG Wei, LI Dan, LIU Yang, LI Jun-jiao, FAN Meng, SHI Qi-peng, YANG Guo-dong

(HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang，Henan，471003,China)

Huanglian Jiedu decoction was employed to test its antibacterial effect on the common clinical pathogenic bacteria (E.coli,S.aureus,Salmonella) by using agar diffusion plate method and tube twice times dilution methodinvitro.Results of agar diffusion plate method showed that the inhibition zone diameters ofE.coli,S.aureus,Salmonellawere 7.50 mm±0.50 mm, 14.00 mm±0.80 mm, 10.63 mm±0.89 mm, respectively.Results of tube twice times dilution method showed that the minimal inhibitory concentrations (MIC) ofE.coli,S.aureus,Salmonellawere 250.0, 31.25, 250.0 g/L, respectively; and the minimum bactericidal concentrations(MBC) ofE.coli,S.aureus,Salmonellawere 500.0, 250.0, 250.0 g/L, respectively.Results of decomposed recipes experiment showed that antibacterial effect of Radix Scutellariae onS.aureusbasically coincided with that of Huanglian Jiedu decoction.Radix Scutellariae is the principal agent of Huanglian Jiedu decoction in the antibacterial experiment.Rhizoma Coptidis had obvious antagonism against Radix Scutellariae on the antibacterial effect.The results provided theoretical basis for clinical application of Huanglian Jiedu decoction.

Huanglian Jiedu decoction；antibacterial testinvitro；decomposed recipe

2016-06-16

河南科技大学大学生研究训练计划(SRTP)项目(2014266)；国家自然科学基金项目(31302133)；河南科技大学博士启动基金项目(09001731)；河南省产学研合作项目(162107000031)

王 维(1992-) 女，河南新乡人，学士，主要从事中药药理学研究。*通讯作者

S853.7

A

1007-5038(2016)11-0065-05