猪场粪污中大肠埃希菌磺胺类耐药基因型及表型分析

魏 勇，陈美琪，王 利*，肖 云, 于吉锋，李兴玉

(1.四川省畜牧科学研究院，四川成都，610066；2.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041;3.四川省大竹县畜牧局，四川大竹 635100)



猪场粪污中大肠埃希菌磺胺类耐药基因型及表型分析

魏 勇1，陈美琪2，王 利2*，肖 云3, 于吉锋1，李兴玉1

(1.四川省畜牧科学研究院，四川成都，610066；2.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041;3.四川省大竹县畜牧局，四川大竹 635100)

为了检测猪场粪污中大肠埃希菌对磺胺类药物的耐药状况，用美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的药敏纸片扩散法检测11株猪场粪污中大肠埃希菌对磺胺类药物的耐药性表型，用multi-PCR Kit检测磺胺类药物的耐药基因(sul1,sul2,sul3)。结果表明,11株猪场粪污中大肠埃希菌对磺胺复合物的耐药率为45%，磺胺二甲基恶唑耐药率为45%,磺胺甲基恶唑耐药率为64%。磺胺类药物的Sul 1基因检出率为100%，sul 2基因检出率为90.9%，sul 3基因检出率为36.4%，磺胺类抗生素耐药基因的总检出率为100%。研究结果可为大肠埃希菌的耐药性研究以及磺胺类耐药机制的研究提供科学依据。

猪场粪污；大肠埃希菌；磺胺类；耐药基因

大肠埃希菌(E.coli)是人和动物肠道中普遍存在的一类肠道共生菌，也是一种人兽共患的条件致病的革兰阴性短杆菌。大肠埃希菌也是一种环境常在菌，但大肠埃希菌的出现通常与粪污密切相关，也通常作为环境样品生物测试污染指示物[1]。大肠埃希菌也经常作为抗菌素耐药基因的贮存库，在细菌耐药性分析及耐药基因传递研究方面起着非常重要的作用[2-3]。环境中细菌耐药基因的消除情况也直接关系到人类医疗及动物疫病防控过程中抗生素药物的临床应用。近年来，随着规模养殖产业的迅速发展，大肠埃希菌等细菌病原对于动物健康的危害日趋广泛而复杂，这也就直接导致了抗菌药物的大量使用，使细菌耐药及耐药基因传递逐渐成为广泛关注的严峻问题[4-8]，这给养殖业的健康发展埋下隐患，更为人与动物疾病的预防及治疗带来了极大的危害。

磺胺类药物是一类人工合成的抗菌药物，它具有造价便宜，抑菌作用显著，理化性质稳定，药效持久，操作方便等诸多优点。其主要作用机制是阻碍二氢叶酸的合成，从而抑制细菌的发育和繁殖，这在治疗动物疾病的应用中具有重要意义[9]。目前，有关致病性大肠埃希菌分离株耐药性研究表明其对卡那霉素、氨苄西林、庆大霉素等具有较高的耐药性等[10]，关于猪场粪污中大肠埃希菌对磺胺类药物耐药性的检测与分析尚鲜见。本试验主要探讨猪场粪污中大肠埃希菌对于磺胺类药物的耐药性，以期为大肠埃希菌的耐药性研究提供基础数据，同时为粪污的再次利用及粪污中细菌耐药基因对环境造成污染等方面的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本试验11株大肠埃希菌来源于四川省嘉陵江上游5个饲养管理规范的大型猪场的粪污样品中，按照常规方法对大肠埃希菌进行分离纯化以及生化鉴定，然后进行16 S rDNA验证，最后大肠埃希菌分离株在-20℃以200 mL/L的甘油保存备用。

1.1.2 主要试剂 伊红美蓝培养基、SS琼脂、麦康凯琼脂、营养肉汤培养基等均为北京奥博星生物技术有限责任公司产品；肠杆菌科细菌生化编码鉴定管GYZ 15E为杭州天和微生物试剂有限公司产品；MH培养基、药敏纸片为广州迪景公司产品；药敏质控菌大肠埃希菌ATCC25922为卫生部药品生物制品鉴定所生产；Mix、DNA Marker、DNA胶回收试剂盒、琼脂糖等为博瑞克生物公司产品；PCR引物由上海生工生物技术服务有限公司合成；Personal cycler PCR仪，Biometra公司产品；电泳仪，Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 大肠埃希菌耐药基因型检测 采用四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室研制的“细菌对磺胺类药物耐药基因三重PCR检测试剂盒”对所分离的大肠埃希菌进行磺胺类抗生素耐药基因检测。参照文献[11]设计磺胺类耐药基因引物，引物序列见表1。由上海生工生物技术服务有限公司合成引物。PCR 反应体系为模板 DNA 0.8 μL，dd H2O 5.6 μL，2 ×TaqPCR Master Mix 7 μL，上、下游引物各 0.8 μL，共 15μL。PCR 扩增反应条件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共35 个循环；72 ℃ 5 min。取 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，120 V电压，电泳 30 min，用凝胶成像仪观察并拍照。

表1 磺胺类耐药基因引物序列

1.2.2 大肠埃希菌耐药表型检测 对分离得到的大肠埃希菌在超净工作台内进行药敏试验，采用美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的药敏纸片扩散法，用琼脂稀释法检测大肠埃希菌分离株对于磺胺药物的敏感性，测定对磺胺类药物的最小抑菌浓度(MIC)，将大肠埃希菌ATCC25922做为质控菌株。其判定结果根据NCCLS(2009)的标准，对耐药性以敏感和耐药两种形式进行记录。

2 结果

2.1 大肠埃希菌耐药基因检测结果

采用 multi-PCR 试剂盒对11株大肠埃希菌分离株进行磺胺类药物的耐药基因检测，11株大肠埃希菌中均检测出的sul 1基因，有10株检测出sul 2基因，sul 3基因在4 株大肠埃希菌中检出。由此可知，sul 1基因检出率为100%，sul 2基因检出率为91%，sul 3基因检出率为36%。磺胺类抗生素耐药基因multi-PCR检测结果见图1。

2.2 大肠埃希菌耐药性表型检测结果

大肠埃希菌分离株进行磺胺类药物的耐药表型

检测结果表明，磺胺复合物(S3)、磺胺二甲基恶唑 (SF)、磺胺甲基恶唑 (RL)抑菌效果均较差，敏感率较低。表型检测可知大肠埃希菌分离株对于磺胺类药物的耐药性较高(表2)。上述结果表明，分离的猪场粪污中大肠埃希菌对磺胺类药物的耐药性已经相当严重。本试验所检大肠埃希菌分离株磺胺类药物的总检出率为100%，有55%的菌株表现为多重耐药。由此可知，磺胺类药物不适合在本试验采集样品的养殖场继续使用。

3 讨论

大肠埃希菌及其耐药性研究具有重要的医疗临床及公共卫生意义，吸引了大量相关研究。植婵萍等[12]报道的种鹅大肠埃希菌对于磺胺类药物复方新诺明的耐药率在90%以上。周莹等[13]报道聊城地区鸡源致病性大肠埃希菌对于磺胺类药物磺胺甲噁唑的耐药率在77.8%以上，这与本试验研究结果相类，表明大肠埃希菌对磺胺药物普遍表现耐药，在具体检出率上存在差异。这种检出率差异可能来自于不同养殖品种、不同的病原菌谱系、不同的用药习惯、不同的药物使用频率等等，导致菌株在对磺胺耐药性的产生、携带、传递及消减周期表现存在差异。但总体看来，大肠埃希菌对磺胺药物的敏感率呈明显下降趋势，原因可能是由于抗菌药物长期、大量的不合理使用，也可能是因为大肠埃希菌对外界环境有较强的适应能力，使大肠埃希菌对药物的抗性增加。

1～11.大肠埃希菌菌株编号；M.DNA标准DL 1 000

1-11.Codes ofE.coliisolates；M.DNA Maker DL 1 000

图1 大肠埃希菌分离株中磺胺类药物耐药基因检测结果

Fig.1 Detective results of sulfonamide-resistant genes ofE.coliisolates

表2 大肠埃希菌耐药表型检测结果

注：“R”表示耐药；“S”表示敏感。

Note："R"represents resistance;"S"represents sensitive.

磺胺类药物具有抗菌谱广，抑菌效果显著等优点，被广泛应用于动物疾病的治疗，但因其应用较为普遍，细菌对其耐药性也迅速增加。大肠埃希菌对磺胺类药物的耐药机制，是由于携带耐药基因的质粒可以通过一系列作用而在细菌之间以较高的频率进行转移，从而导致了新二氢叶酸合成酶的出现，它具有可替代性及对磺胺类药物亲和力更低的特点。而编码这类酶的sulR基因可以在细菌间通过整合子、转座子以及质粒等方式进行传递，并且该基因可导致二氢叶酸合成酶表达水平提高，从而导致大肠埃希菌对磺胺类药物的抗性增加[1]。sulR基因包括sul1、sul2、sul3这3种基因，其中sul2基因在猪源大肠埃希菌中分布是最广泛的，在大肠埃希菌对磺胺药物耐药性方面的研究也具有重要意义[14]。本试验中，sul 1基因检出率为100%、sul 2基因检出率为90.9%、sul 3基因检出率为36.4%，与以上研究结果相似；sul3基因的检出率略低，究其原因可能是由于大肠埃希菌本身所拥有的该基因较少，也可能是由于基因的突变或质粒的缺失而导致的。

大肠埃希菌在猪场生产线上普遍存在，磺胺药物在规模猪场应用面也较广泛。本试验通过检测猪场粪污中大肠埃希菌对磺胺药物的耐药性，及时了解大肠埃希菌对磺胺药物耐药状况及其分子流行病学，探索其耐药基因分布及传播规律，并为大肠埃希菌的临床防治、磺胺耐药性研究以及寻找养殖粪污中耐药研究的生物指示器提供科学依据。

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Detection of Drug Resistance Phenotypes and Genotypes of Sulfonamides inEscherichiacoliIsolated from Piggery Wastes

WEI Yong1，CHEN Mei-qi2,WANG Li2, DUAN Hui-qin2,XIAO Yun3,YU Ji-feng1,LI Xingyu1

(1.SichuanAnimalScienceAcademe,Chengdu,Sichuan,610064,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan,610041,China; 3.AnimalHusbandryBureauofDazhuCounty,Dazhu, 635100,China)

In order to understand the drug resistance of sulfonamides inEscherichiacoliisolated from piggery wastewater, eleven isolates ofE.coliwere analyzed by K-B method according to the recommendation of the CLSI.Then, multi-PCR Kit method was used to detect sulfonamides-resistant genes(sul1,sul2,sul3).The result shows that resistant rates of elevenE.coliisolates to peptidylsulfanilamide, sulfamoxole and sulfamethoxazole were 45%，45% and 64% respectively.The detection rates of sul 1, sul 2 and sul 3 gene were 100%, 90.9% and 36.4%,respectively.The detection rate of all sulfonamide resistance genes was 100%.It will benefit the further study of drug-resistant mechanism ofE.coli.

E.coli；sulfonamide；drug resistance gene; piggery waste

2015-10-28

四川生猪产业技术体系创新团队项目(sccxtd-004)； 四川省富民强县项目(邻水县优质生猪健康养殖关键技术集成与产业化示范，2014)

魏 勇(1974-)，男，四川南充人，博士，副研究员，主要从事兽医微生物学研究。*通讯作者

S852.612;S859.795

A

1007-5038(2016)11-0057-04