跑台运动对兔前交叉韧带断裂后膝关节软骨的影响

钟名金 刘振龙 张继英 李玳 胡晓青 敖英芳

北京大学第三医院运动医学研究所（北京 100191）

跑台运动对兔前交叉韧带断裂后膝关节软骨的影响

钟名金 刘振龙 张继英 李玳 胡晓青 敖英芳

北京大学第三医院运动医学研究所（北京 100191）

目的：建立一种可有效用于研究兔前交叉韧带（ACL）断裂后运动对软骨影响的实验运动模型，进而研究早期运动对兔ACL断裂后关节软骨的影响。方法：45只成年新西兰大白兔（4~5月龄，体重2.5~ 3kg），随机平均分为：I组，假手术自由活动组（Sham组）；II组，前交叉韧带切断（ACL transection）自由活动组（ACLT组）；III组，前交叉韧带切断跑台运动组（ACLT with exercise，ACLT+Ex组）。运动组在实验跑台上定期运动，运动始于术后第5天，运动强度为5天/周，10分钟/天，跑台速度为0.3英里/小时（约8米/分钟）。分别于术后第2、3、4周每组处死5只兔子，对兔膝关节股骨髁软骨进行印度墨汁染色大体观评分、组织学和二型胶原免疫组化染色并使用国际骨关节炎研究会（OARSI）软骨损伤评分系统进行软骨损伤评估。结果：术后2周，Sham组、ACLT组和ACLT+Ex组未见明显软骨损伤；术后3周、4周，Sham组软骨未见明显损伤退变；ACLT组和ACLT+Ex组均出现软骨损伤，在大体观评分和OARSI分级、分期、总分上分别与Sham组存在显著统计学差异；ACLT组与ACLT+Ex组在大体观评分和OARSI软骨损伤评分上无统计学差异。结论：跑台运动是可用于研究兔ACL断裂后对关节软骨损伤研究的有效实验运动模型；兔ACL断裂后早期出现关节软骨损伤，但与笼养自由活动相比，实验跑台运动对关节软骨损伤进程无影响，表明ACL断裂后早期进行合理运动与康复不会加重膝关节软骨损害。

前交叉韧带断裂；软骨损伤；运动；实验跑台

前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）断裂是临床中十分常见的运动创伤。ACL断裂后造成膝关节活动时失去维持胫骨前向稳定的限制力，关节不稳引发关节软骨退变加剧，最终导致骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）的发生[1]。文献报道，ACL断裂后OA的发生率、严重程度与伤后关节活动方式和强度有密切关系[2]。动物模型可以很好地反映ACL断裂后关节软骨损伤的病理变化过程。兔膝关节与人膝关节的解剖相类似，并且兔易获得、易饲养和经济成本低，因此兔前交叉韧带切断（anterior cruciate ligament transection，ACLT）是模拟ACL断裂和进行相关实验研究的合适模型[3]。实验模型原则上应该尽可能模拟临床患者的日常活动或运动情形。既往文献报道的关于兔ACL断裂后的活动只限于笼养自由活动[4]，不能反映临床上人的日常活动和运动，也无法进一步研究运动条件下软骨损伤的病理变化。因此需要建立一种用于兔ACL断裂后的运动模型，来模拟ACL断裂后的运动，进而观察ACL伤后运动对关节软骨的影响。本研究通过切断兔ACL并予以跑台运动来模拟ACL断裂后的运动，观察兔ACL断裂后早期运动对关节软骨的影响，从而为ACL断裂后进行早期合理运动和康复提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由北京大学医学部动物部提供成年新西兰大白兔，4~5月龄，体重2.5~3 kg，共45只，由专业饲养员分笼饲养，所有动物均可充分获得食物和饮用水。

1.2 兔运动炮台及运动方案

实验跑台采用兔运动训练跑台（北京智鼠多宝生物科技公司）。根据实验设计要求，跑台主要由跑道、电机、操作台、升降机等构成。跑台内含3个跑道，规格为1560 mm×996 mm×280 mm，长度适用于兔的奔跑，跑道速度由电动马达驱动，速度可无级调整，范围为1~ 40米/分（图1）。兔运动开始于手术后第5天，每周5天，每天10分钟，跑台速度为0.3英里/小时（约8米/分钟）。Oyen-Tiesma等[5]研究认为此运动方案符合兔的运动量，可安全有效地用于兔运动损伤的相关研究中而不会产生任何相关并发症或继发性损伤。自由活动组仅限于饲养笼（550 mm×450 mm×400 mm）内活动。

图1 兔实验跑台（a）及兔在跑台上进行运动（b）

1.3 实验动物与分组

兔经过1周的适应性笼养后，随机均分为3组：I组，假手术自由活动组（Sham组）；II组，前交叉韧带切断自由活动组（ACLT组）；III组，前交叉韧带切断跑台运动组（ACLT with exercise，ACLT+Ex组）。每组分别于术后2、3、4周处死兔子获取膝关节，每次每组5只兔子。

1.4 手术方法（图2）

图2 手术方法

采用耳缘静脉注射20%乌拉坦（5 ml/kg）对动物进行全身麻醉，将膝关节固定、备皮、消毒及铺巾，经膝关节内侧髌旁切口，逐层分离至打开关节腔，将髌骨向外侧脱位后屈膝下完全暴露前交叉韧带，用眼科剪在韧带中段予以切断并剪除2 mm韧带组织防止粘连愈合，行Lachman试验确定韧带完全切断，生理盐水冲洗关节腔，将髌骨复位，严密缝合关节腔及皮肤。假手术组动物采用相同的切口在相同条件下切开皮肤和打开关节腔，暴露前交叉韧带不予以切断，生理盐水冲洗后关闭伤口。为防止术后关节感染，术后予以每只动物肌注40万单位的青霉素，连续3天。

1.5 大体形态观察

解剖膝关节，充分暴露股骨髁，观察股骨內外髁软

骨的大体形态，进行印度墨汁染色后并采用如下评分系统进行评价[6]：1分：软骨表面光滑，色泽光鲜，无墨汁残留；2分：软骨表面裂隙，范围0~4 mm；3分：软骨表面裂隙，范围4~8 mm；4分：软骨表面裂隙，范围大于8 mm；5分：软骨全层磨损，深度0~2 mm；6分：软骨全层磨损，深度2~5 mm；7分：软骨全层磨损，深度大于5 mm。股骨内外髁软骨损伤墨汁染色的平均分代表股骨髁软骨损伤分值。

1.6 组织学和II型胶原兔免疫组化染色

大体观察后将兔膝关节固定于4%的中性多聚甲醛固定溶液中，固定72小时。标本经固定后自来水冲洗，用10%甲酸脱钙液进行脱钙，每日更换脱钙液至脱钙充分，标本用蒸馏水漂洗，至恢复中性PH。修整股骨内外髁软骨组织，经脱水、透明、浸蜡、包埋后，以5 μm/层切片，行苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin，HE）、甲苯胺蓝染色（Toluidine Blue）。组织学评分采用国际骨关节炎研究会（Osteoarthritis Research Society International，OARSI）推出的关节软骨组织病理学评分系统[7]，此评分系统能准确评估软骨损伤情况。HE染色主要用于观察软骨的层次结构，甲苯胺蓝可以观察软骨蛋白多糖的含量。该评分系统根据软骨损伤严重性和深度将软骨损伤分为0~6级（Grade0~Grade6）（表1），根据软骨损伤范围将软骨损伤分为0~4期（Stage0~ Stage4）（表2），最终的OARSI总分为分级与分期的乘积（0~24分）（表3）。将股骨内外髁软骨损伤分级、分期和总分的平均分代表股骨髁软骨损伤分值。同时对软骨组织切片采用“二步法”进行II型胶原（COL.II）免疫组化染色用于观察软骨基质的II型胶原变化。

表1 OARSI分级（Grade 0~Grade 6）

表2 OARSI分期（Stage 0~Stage 4）

表3 OARSI总分

1.7 统计学处理

数据采用中位数（最小值，最大值）表示，采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，两组中位数的比较采用非参数Mann-Whitney检验进行，三组间两两比较调整了检验水准，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后2周软骨损伤情况

术后2周，Sham组、ACLT组和ACLT+Ex组软骨均未见明显损伤，软骨表面光滑，色泽鲜亮，无墨汁残留。HE组织学染色表现为软骨结构清晰，软骨结构完整。甲苯胺蓝染色表现为软骨染色均一，糖原含量无减少。II型胶原免疫组化染色未见II型胶原丢失。软骨墨汁染色评分和OARSI分级、分期及总分统计结果表明三组间无统计学差异（图3）。

图3 术后2周股骨髁软骨印度墨汁染色、组织学及II型胶原染色评估

2.2 术后3周软骨损伤情况

术后3周，Sham组股骨髁软骨未出现损伤，软骨表面完整，无墨汁残留；组织染色上软骨层次清晰，糖原无减少，II型胶原丰富。ACLT组可见软骨表面墨汁残留，软骨表面出现粗糙、裂隙；组织染色上表现为软骨出现裂隙、表面纤维化，糖原染色降低，II型胶原轻

度减少。ACLT+Ex组软骨表面墨汁残留，有表浅溃疡，组织学上出现软骨表面结构紊乱，软骨细胞坏死、肿胀，糖原和II型胶原染色变淡。软骨墨汁染色评分和OARSI分级、分期及总分统计结果表明，ACLT组和ACLT+Ex组分别与Sham组存在显著统计学差异；ACLT组与ACLT+Ex组无统计学差异（图4）。

图4 术后3周股骨髁软骨印度墨汁染色、组织学及II型胶原染色评估

2.3 术后4周软骨损伤情况

术后4周，Sham组软骨表面光滑，未见磨损退变，无墨汁残留。组织染色上软骨完整，糖原和II型胶原含量无减少。ACLT组软骨损伤明显加重，墨汁染色可见软骨表面溃疡，部分软骨出现软骨下骨暴露，损伤范围超过软骨面积的50%以上，组织染色上表现为软骨结构消失，出现溃疡、剥离深达软骨下骨，糖原和II型胶原丢失。ACLT+Ex组软骨损伤也进一步加重，在墨汁染色上出现墨汁残留，软骨表面纵行裂隙、溃疡，直达软骨下骨，损伤范围明显扩大，组织学上软骨结构紊乱、层次消失，软骨剥离、纤维化，糖原和II型胶原染色变淡。软骨墨汁染色评分和OARSI分级、分期及总分统计结果表明，ACLT组和ACLT+Ex组分别与Sham组存在显著统计学差异；ACLT组与ACLT+Ex组无统计学差异（图5）。

图5 术后4周股骨髁软骨印度墨汁染色、组织学及II型胶原染色评估

3 讨论

前交叉韧带（ACL）是维持膝关节前向稳定的重要组织结构，ACL断裂后导致胫骨出现向前的反向异常活动，造成关节间的接触力和接触面发生改变，关节软骨在异常应力的作用下出现关节软骨损伤，表现出软骨磨损退变，甚至全层脱离，软骨下骨暴露，进而发展为OA[8]。临床研究发现，ACL断裂后关节软骨损伤的严重程度与时间呈正相关性，一般来说ACL断裂后1年内关节软骨磨损已经很严重[9]。为了更好地观察ACL断裂后关节软骨损伤的病理变化过程，需要建立合适的动物模型。大鼠ACL切断后，术后1周即可出现软骨损伤，软骨表层软骨细胞丢失、肿胀、纤维化，术后2周软骨损伤进一步加重，术后4周已经出现明显的软骨损伤[10]。在犬和小型猪等ACL断裂模型中，软骨损伤出现在术后1~2个月[11，12]。大鼠ACL断裂模型中软骨损伤出现很早，不利于发现很早期的软骨损伤，而大型动物模型软骨损伤出现时间晚，同时面临着获取不便、饲养困难和经济成本高等不利因素，因此，在ACL断裂动物模型中，往往选择兔作为建立ACL断裂的合适动物。本实验和我所前期的研究结果表明，兔ACL断裂后，软骨损伤出现在术后第3周，出现早期软骨损伤表现，术后4周软骨损伤加重，表现为中晚期软骨损伤[4]，与文献报道结果一致[13]。

ACL断裂后软骨损伤的损伤率、损伤程度与伤后膝关节活动方式和强度存在密切联系。临床上也有一部分ACL断裂患者由于误诊、漏诊和自身条件等因素无法及时行ACL重建术，患者在伤后仍进行运动。因此需要建立一种可有效用于观察ACL断裂后运动对软骨影响的实验运动模型，来研究ACL断裂后运动对关节软骨的影响。研究已证实关节制动会导致肌肉萎缩、关节僵硬，关节失去活动，关节软骨失去了通过关节活动产生的力学刺激来维持软骨营养的动力，导致软骨营养代谢障碍，引发软骨退行性改变[14]。关节的持续被动活动（continuous passive motion，CPM）可以刺激软骨细胞代谢，持续的应力和适当的负荷可以调节软骨细胞的代谢反应，增加蛋白多糖等软骨基质的合成，改善软骨质量，从而起到保护软骨的作用[15]。目前CPM更多应用于ACL重建术后和软骨修复术后的康复。Galois等[16]研究了不同运动强度对膝OA软骨的影响。他们切断大鼠ACL后予以不同强度的运动，通过观察关节软骨的损伤程度，发现适度的运动可以保护关节软骨，而过度的运动则加重软骨损伤。但是，目前尚无关于兔ACL断裂后运动对关节软骨影响的研究报道。本实验首次应用实验跑台运动来研究兔ACL断裂后早期运动对关节软骨的影响。

本研究中兔的运动为ACL切断术后第5天开始，在实验跑台上进行，每周5天，每天10分钟，跑台速度为0.3英里/小时（约8米/分钟）。Oyen-Tiesma等[5]研究认为，兔可以很好地适应于该运动强度，长期进行该强度的运动不会出现并发症和继发性损伤，因此，该运动方案是建立兔实验运动模型并进行相关研究的成熟有效方案。Bryan等[17]应用此运动方案研究兔髌腱重建ACL，发现早期关节主动运动可以改善取腱区的腱组织愈合，增强取腱区的塑形改造能力，增加髌腱术后强度。本研究通过观察ACL断裂后股骨髁软骨的大体观与组织学，发现ACL断裂后无论进行跑台运动与否，关节软骨损伤都不可避免，ACLT+Ex组与ACLT组均在术后第3周出现软骨损伤，术后第4周软骨损伤进一步加重。在术后第3周和4周，ACLT组、ACLT+Ex组和Sham组间在大体观评分和OARSI分级、分期和总分上存在统计学显著差异。术后2、3、4周，ACLT组与ACLT+Ex组间在各评分上均无统计学差异，这表明兔ACL断裂后，无论笼养自由活动还是实验跑台运动，均出现早期软骨损伤，与笼养自由活动相比，实验跑台运动在早期对关节软骨损伤的进程无影响。

临床研究对比运动员与非运动员ACL断裂后软骨损伤的情况发现，运动员ACL断裂后软骨损伤率并不比非运动员软骨损伤率高。虽然运动员在ACL伤后的运动量和运动强度较非运动员都要大，但是由于运动员具备了专业的训练以及良好的医务监督条件，伤后即使从事高强度、大运动量运动训练和比赛，只要通过安排合理的运动和康复，就可以一定程度上降低和减轻软骨损伤的发生[18]。本动物实验研究的运动方案为兔合适的运动强度，符合兔的日常活动和运动量，对比兔ACL断裂后运动与不运动关节软骨损伤情况，发现运动并未加重软骨损伤。因此，我们认为，ACL断裂后早期合适的运动未必会加重软骨损伤。ACL断裂后早期进行合理的运动调整和康复，不会加重软骨损伤，其原因可能有以下几点：（1）ACL断裂早期肌肉并未萎缩，而肌肉力量是维持关节稳定和避免韧带损伤的关键[19]。（2）运动强度相对低、温和，没有急转、急停等产生切线力的动作，进行合理适宜的运动不会对软骨造成不利影响[20]。（3）临床上ACL断裂的原因往往是暴力，通常造成外侧股骨髁软骨与外侧胫骨平台软骨的“对吻伤”，而局部软骨损伤可能造成关节其他部位软骨损伤[21]。实验中通过手术切断ACL并没有暴力作用而造成的软骨损伤。但是在临床工作中，对ACL断裂后的患者，如何合理调整伤后的运动强度、运动方式和运动时间等方面需要进一步研究，而且要考虑长期活动对关节软骨的影响，以免不恰当的运动方案加重关节软骨损伤。

4 结论

跑台运动是可用于研究兔ACL断裂后对关节软骨影响的有效实验运动模型；兔ACL断裂后早期出现关节软骨损伤，但与笼养自由活动相比，本实验跑台运动对关节软骨损伤进程无影响，表明ACL断裂后早期进行合理运动与康复不会加重膝关节软骨损害。在临床实践中，应结合ACL断裂患者的实际情况合理调整运动方案，以免对关节软骨造成不利影响。

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Early Treadmill Exercise Has no Harmful Effect on Articular Cartilage in the Rabbits after Transection of Anterior Cruciate Ligament

Zhong Mingjin，Liu Zhenlong，Zhang Jiying，Li Dai，Hu Xiaoqing，Ao Yingfang
Institute of Sports Medicine，Peking University Third Hospital，Beijing，China 100191 Corresponding Author：Ao Yingfang，Email：yingfang.ao@vip.sina.com

Objective To establish an effective model for investigating the effects of early exercise on articular cartilage in rabbits following anterior cruciate ligament transection（ACLT）.Methods Forty-five New Zealand white rabbits（4~5 month-old，2.5~3kg）were randomly separated into group I（sham operation and free cage activity），group II（ACLT and free cage activity）and group III（ACLT plus treadmill exercise）.Animals in group III after 5 days of surgery were forced to run on a treadmill 10 min a day at a speed of 0.3mph，5 days a week.5 rabbits from each group were sacrificed respectively at week 2，3，and 4 after surgery and their femur condyles cartilage from both knees were assessed by Indian ink and Osteoarthritis Research Society International（OARSI）histological analysis，and type II collagen was tested by immunohistochemical analysis. Results There was no significant cartilage lesion in the three groups 2 weeks after surgery.Cartilage was intact in group I at week 3 and 4 after surgery，while cartilage degeneration appeared in both groups II and III. There were significant differences in mean macroscopic score and mean OARSI grade，OARSI stage，OARSI score between group I and group II.There were no significant differences in macroscopic assessment and OARSI histological evaluations between group II and group III.Conclusion Early cartilage injury occurred after ACL rupture and treadmill exercise produced no effects on articular cartilage degeneration process in

anterior cruciate ligament transection，cartilage injury，exercise，treadmill

2016.01.25

国家自然科学基金项目（81171726）

敖英芳，Email：yingfang.ao@vip.sina.com

comparison with free cage activity，suggesting that early reasonable exercise and rehabilitation would not aggravate articular cartilage damage following ACL injury.