传统稀释液配方中添加不同保护剂对藏羊精液冷冻效果的影响

2016-12-09马元梅张晋青常永梅扈添琴

中国草食动物科学 2016年6期

关键词：顶体细管保护剂

马元梅，张晋青，常永梅，扈添琴，赵静，张楠

（青海省家畜改良中心，西宁 810016）

传统稀释液配方中添加不同保护剂对藏羊精液冷冻效果的影响

马元梅，张晋青，常永梅，扈添琴，赵静，张楠

（青海省家畜改良中心，西宁 810016）

为探索在传统稀释液配方中添加保护剂对藏羊精子的冷冻保存效果，在传统稀释液配方（果糖-蔗糖-柠檬酸钠-甘油）中，由Tris（三羟甲基氨基甲烷）代替柠檬酸钠，乙二醇代替甘油，在果糖-蔗糖-Tris-乙二醇基础上添加维生素B12、维生素E、维生素C、复合维生素B等，以增强精子缓冲力，减少毒性，提高精子活力、顶体完整率及受精力。结果表明：精液冷冻保存稀释液中添加Tris比添加柠檬酸钠有更好的冷冻保存效果，能有效改善冻后精子活力和顶体完整率；精液冷冻保存稀释液中添加维生素B12对精子有良好的保护作用；用等体积乙二醇代替甘油作为防冻剂，对精子冷冻时的保护作用不亚于甘油；藏羊细管冷冻精液的制作中，用果糖-蔗糖-Tris-乙二醇-维生素B12组合稀释液配方进行2次稀释，8min冷冻，其冷冻效果最佳，顶体完整率最高。

传统稀释液；保护剂；藏羊；冷冻效果

精液保存时，精清对精子的保护作用是有限的，需要对精液进行稀释来保护精子，尤其在精液降温平衡、冷冻、解冻过程中，稀释可在一定程度上减轻对精子的损伤。精子复苏率与顶体完整率的高低完全取决于精液稀释液中营养保护剂对精子保护和减少冷打击的作用，进而保护精子细胞免受应激［1］。有资料表明：绵羊精液有其特殊性，有较高的代谢水平，在氧的作用下可以迅速氧化导致精子中毒和死亡［2］。稀释液中添加保护剂三羟甲基氨基甲烷（Tris）对代谢酸中毒和酶活动具有良好的缓冲作用，维生素类的添加剂具有改进精子活率，提高受胎率的作用［3］，用乙二醇作为精液冷冻保护剂具有比甘油更好的效果，且能明显提高冻后精子的顶体完整率［4］。

为此，本试验以传统稀释液配方为基础液，在藏羊精液稀释液中先添加缓冲剂Tris，再用渗透性保护剂乙二醇代替甘油，最后逐个加入营养添加剂维生素B12、维生素E、维生素C和复合维生素B，以研究不同保护剂对精液精子活力、顶体完整率及受精力的影响，旨在为提高藏羊的受胎率和繁殖率提供理论依据。

1　材料与方法

1.1主要试剂及设备

蔗糖、果糖、柠檬酸钠，均由北京化学试剂二厂生产；三羟甲基氨基甲烷、乙二醇，由上海山浦化工有限公司生产；维生素B12、维生素E、维生素C、复合维生素B，由石药银湖制药有限公司生产；纯化水，由青海省家畜改良中心冻精生产实验室自制；姬姆萨染液由西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司提供。

相差显微镜（型号为BX43），由OLYMPUS公司生产；密度测定仪、卡苏细管冻精（灌装、封口、印字）一体机、程控冷冻仪，均由法国卡苏科技有限公司提供。化学试剂均为分析纯以上。

1.2试验羊只和方法

1.2.1羊只从青海省内种羊场引进1.5～2岁藏羊种公羊6只，在青海省家畜改良中心全舍饲饲喂青海省三江源饲料公司生产的肉羊混合饲料，经过3～5个月的驯化、调教，采集精液。

1.2.2方法以传统稀释液配方为基础液，藏羊精液稀释液中先添加缓冲剂Tris，再用渗透性保护剂乙二醇代替甘油，最后逐个加入营养添加剂维生素B12、维生素E、维生素C和复合维生素B，进行精子活力、顶体完整率及受精能力研究。采集精液，镜检鲜精活力在65%以上，精子密度每毫升20亿以上，冻精生产严格按NY/T 1234—2006牛冷冻精液生产技术规程。在不同稀释液配方、相同的平衡时间、相同的冷冻曲线和冷冻时间、相同的解冻温度和时间条件下冷冻保存。随机抽取不同稀释液配方细管冻精2剂。解冻后剪去超声波封口端，用推针从棉塞端将精液推入小试管中混匀，从中层吸取5μL，进行活力观察，剩余的精液用2.9%柠檬酸钠进行1∶5稀释混匀，在其中层取一小滴精液，于洁净的玻片一端，常规抹片、染色，观察精子顶体完整性。试验重复5次。

1.3稀释液配方筛选

本试验的稀释液配方见表1。

表1　藏羊细管冻精稀释液配方

1.4精液的采集与精液品质测定

1.4.1采精前准备清洁种公羊体表，清洗包皮。

1.4.2采精频率每星期采精3次，每次可根据体质等情况，连续排精2次（间隔时间15～20min）。

1.4.3采精方法采用真台羊、假阴道方法。采精室及用具须清洁，消毒；假阴道温度适中（36～39℃），气压、润滑剂调试正常。

1.4.4精液品质检查鲜精采集后，先用10μL移液枪取5μL于载玻片上，盖上盖玻片，放入38℃恒温相差显微镜下观察活力，再用电子天平称重法计算出采精量，最后用法国卡苏公司1181密度仪测定精液密度。藏羊鲜精品质检查结果见表2。

表2　藏羊鲜精品质检查参数及结果

1.5精液冷冻保存与解冻

1.5.1精液的稀释与平衡基础液的配制：各配方基础液所用化学药品精确称量后，放入容器为100mL的量筒内，加蒸馏水50mL左右，用消毒过的玻璃棒搅拌，待溶解后再加蒸馏水定容至100mL，混匀后用滤纸过滤于三角烧杯中，扎好瓶口，置水浴锅中隔水煮沸消毒30min。冷却后加入青、链霉素各10万IU即构成基础液。基础液加15%（V/V）卵黄即为Ⅰ液，用于2次稀释处理的第1次稀释。取第Ⅰ液45mL，加入隔水煮沸消毒好的5%（V/V）甘油（乙二醇），充分搅拌均匀即构成Ⅱ液。用于两次稀释处理的第2次稀释。

稀释保护剂要现配现用。

1.5.2稀释、平衡采用2次稀释法。先用第Ⅰ液等温1∶1稀释，放入34℃的水浴锅中，10min后加至稀释总量一半，移至5℃冰箱平衡2.5 h，冷冻前0.5 h再用含有甘油（乙二醇）第Ⅱ液加至最终稀释量。

1.5.3精液的冷冻与保存采用细管一体机灌装，灌装后的细管即可用程控冷冻仪进行冷冻，首先在电脑中设置好冷冻的最佳温度曲线，开启液氮罐阀门把冷冻仪的温度降到4℃，将排好细管的细管棉塞封口端对着操作者，超声波封口端远离操作者。冷冻程序如下：4℃→3min -10℃→2min→-100℃→2min→-140℃。冷冻时间7min。冷冻结束后取出并迅速浸泡在液氮中。

1.5.4精液的解冻38～40℃水浴30 s解冻。取公羊细管冻精迅速泡入38～40℃水中并晃动，待溶解后立即取出，擦干细管水珠，剪去细管封口端，取5μL精液，在恒温38℃装置的相差显微镜上检查精子活力，合格冻精入库保存。

1.5.5精子活率评定用10μL移液器取解冻后的精液5μL置于载玻片上，加盖玻片后立即在100倍显微镜下观察活力，显微镜载物台温度保持38℃。每样片观察3个视野，并应观察不同液层内精子的运动状态，进行全面评定。

1.5.6精子活力计算 3个视野精子活力评价的平均值。

1.6精子染色

1.6.1抹片取稀释后鲜精或冻精一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈35°夹角，将样品均匀地涂布于载玻片上，自然风干（约5min）。每样品制作2个抹片。

1.6.2固定在已风干的抹片上滴1.0～2.0mL中性福尔马林固定液，固定15min后用清水缓缓冲去固定液，吹干或自然风干。

1.6.3染色将固定好的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触染液，染色1.5 h后用水缓缓冲去染液，凉干待检。

1.7精子顶体观察

将制备好的抹片在显微镜（400倍）下观察。根据精子顶体完整和损伤与否，将精子顶体形态分为5种类型：

（1）精子顶体完整型：精子头部外形正常，有明显的顶脊，顶体部分呈均匀一致的紫红色，边缘整齐，赤道带清晰。

（2）精子顶体轻微膨胀：顶脊不明显或部分消失，顶体部分的紫红色深浅不一，边缘不整齐；精子尾部与头部的连接点不在精子头的对称轴上；精子头的基部狭窄。

（3）精子顶体严重膨胀型：顶脊完全消失；顶体严重膨胀后出现皱折，染色后出现明显的条纹或精子顶体膨大呈冠状；精子头部与尾部连接点呈明显的偏轴状态。

（4）精子顶体部分脱落：顶体严重膨胀到一定程度后，开始脱离精子，露出被顶体覆盖的细胞核。

（5）精子顶体完全脱落：顶体完全脱落精子，精子核裸露。

1.8精子顶体完整率计算

每个样品制作2个抹片，每个抹片观察200个以上的精子（分左右两个区），取2片的平均值，2片的变异系数不得大于20%，若超过应重新制片。

精子顶体完整率=顶体完整精子数/总精子数× 100%

2　结果与分析

从表3看出，试验组冷冻效果均优于对照组，配方3冷冻效果最好。解冻后精子活力与顶体完整率，配方3与其他配方间均差异极显著（P＜0.01）；配方2与配方1间差异不显著（P＞0.05），但与配方4、配方5、配方6间差异显著（P＜0.05），与配方3间差异极显著（P＜0.01）；配方4、配方5、配方6之间均差异不显著（P＞0.05）。

表3　不同稀释液冻精精子活力、顶体完整率%

3　讨论

（1）稀释液中添加Tris对精子有良好的保护作用，能提高精子活力和顶体完整率。绵羊精液有其特殊性，有较高的代谢水平，在氧的作用下可以迅速氧化导致精子中毒和死亡［5］。Tris还具有良好的缓冲性和渗透性，并且高浓度时对精子毒性也降低。

（2）目前绵羊精液稀释液中，最常用的抗冻保护剂是甘油，但在常温下甘油对精子有毒害作用，对冻后精子活力和顶体完整率具有很大的负面影响。本试验使用乙二醇渗透性好，对细胞毒性小，可在常温时加入，用等体积乙二醇代替甘油作为防冻剂，解冻后精子活力和顶体完整率无明显差异。

（3）资料表明，按每100mL稀释液中添加4~6mL维生素类营养保护剂，精液冷冻、解冻过程中对精子活力、顶体完整率及精子生存指数都有保护作用。试验证明，每100mL稀释液中添加5mL维生素类营养保护剂，冷冻后精液品质都有所提高，但种类不同保护效应不同，维生素B12保护效果最显著。

4　结论

（1）精液冷冻保存稀释液中加0.2 g/100mL Tris比加3.7 g/100mL柠檬酸钠冷冻效果更好，冻后精子活力增加了3个百分点，顶体完整率增加了4.45个百分点。

（2）精液冷冻保存稀释液中加5 g/100mL维生素B12液对精子有良好的保护性。

（3）用等体积乙二醇代替甘油作为防冻剂，对精子冷冻时保护作用不亚于甘油。

（4）藏羊细管冷冻精液的制作中，用果糖-蔗糖-Tris-乙二醇-维生素B12组合稀释液配方进行2次稀释，8min冷冻，冷冻效果最佳，精子顶体完整率最高。

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［3］李妍书.动物繁殖学［M］.2版.北京：农业出版社，1991：150-115.

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［5］李青旺，武浩.动物繁殖学［M］.西安：西安地图出版社，2000：3.

1.3数据处理

表中数据以平均值±标准差表示，结果进行t检验分析。

2　结果

表2显示，舍饲4年羊昼夜采食、反刍、静卧和睡眠时间分别为372.33、417.98、333.23和410.61min，放牧羊分别为481.05、498.24、247.18和212.54min。即舍饲羊昼夜平均采食和反刍时间分别比放牧羊少108.72min（P＜0.01）和80.62min（P＜0.01），而舍饲羊静卧和睡眠时间分别比放牧羊多86.08min（P＜0.01）和198.07min（P＜0.01）。

舍饲羊与放牧羊在昼夜采食、反刍、静卧、睡眠时间比例分别为0.77、0.84、1.35和1.93。

舍饲母羊共20只，产羔13只，产羔率65%；放牧母羊产羔率90%。舍饲母羊临床表现为食欲不振，行动迟缓，目光无神，眼结膜稍有充血，嗜好静卧。舍饲羊瘤胃pH值平均5.6（酸中毒），而放牧羊pH值6.7（正常范围）。

表2　哈萨克羊的昼夜采食、反刍、静卧、睡眠等行为

3　分析与讨论

3.1绵羊酸中毒

上述观察统计研究结果显示，舍饲4年以上成年母羊，其临床表现为酸中毒症状，瘤胃液pH值5.6，也属于酸中毒pH值范围内。韩正康等［7］指出，绵羊瘤胃液pH值一般在5.0～7.5范围内，而当瘤胃液pH值低于6.5时，已不利于纤维素的消化，而在6以下可导致酸中毒，当pH值为4时，其过量的乳酸可致绵羊死亡。杨占春［8］的研究结果表明，绵羊酸中毒，其瘤胃液pH值范围在4.5～6.0之间，也证实了pH值为5.6属于酸中毒的pH值范围之内。有研究［9-13］报道，绵羊酸中毒轻者可以导致体况消瘦，发情繁殖率降低，生产水平下降，重者甚至导致死亡。本次试验虽然日粮配方全价，草料优质，但舍饲羊食欲较差，羊体消瘦，5岁活重仅在45 kg左右。本观察统计结果与前者研究结果相符。

3.2与舍饲绵羊酸中毒及低繁殖率的关联因素

与放牧羊比较，舍饲绵羊酸中毒和低繁殖率时，往往伴随昼夜静卧和嗜睡时间显著增加，采食、反刍和活动时间明显减少等行为，导致瘤胃食物排出速度降低，滞留时间长，致使瘤胃pH值大幅下降，当其pH值小于5.9时，多表现出瘤胃酸中毒临床症状。

综上所述，参考有关学者研究成果和本试验研究结果表明，为了减轻草场放牧压力，理应提倡绵羊舍饲，但最好不要超过3年。而绵羊短期和半舍饲方法是较好的技术选择，既能减轻草场压力，又能有效避免绵羊生产力的下降，同时也可以充分利用秸秆农作物资源，降低饲养成本，提高绵羊生产潜力。

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