microRNA-499靶控的PI3K/Akt通路在大鼠缺血-再灌注心肌损伤中的作用*

崔瑞新，吕风华，岳 莹，刘亚坤，高建芝

新乡医学院第一附属医院心内一科 新乡 453100



microRNA-499靶控的PI3K/Akt通路在大鼠缺血-再灌注心肌损伤中的作用*

崔瑞新，吕风华#，岳 莹，刘亚坤，高建芝

新乡医学院第一附属医院心内一科 新乡 453100

#通信作者，女，1970年10月生，博士，教授，主任医师，研究方向：冠心病的基础与临床研究， E-mail:doctorlvfh@163.com

心肌；缺血-再灌注损伤；microRNA-499；PI3K；Akt；大鼠

目的：探讨microRNA-499在大鼠心肌缺血-再灌注损伤(MIRI)中的作用及其与PI3K/Akt通路的关系。方法：将30只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和干预组，每组10只。假手术组仅在冠状动脉的左前降支下穿线但并不结扎，模型组结扎冠状动脉左前降支以建立大鼠MIRI模型(缺血30 min,再灌注120 min)，干预组于建立MIRI模型前48 h注射microRNA-499激动剂。采用荧光定量RT-PCR法检测大鼠心肌组织中miRNA-499及PI3K mRNA表达量，Western blot法检测Akt磷酸化活性，采用TTC染色法检测心肌梗死面积。结果：与假手术组相比，模型组miRNA-499及PI3K mRNA表达量减少，Akt磷酸化活性明显降低，心肌梗死面积明显增加(P<0.05)。与模型组比较，干预组miRNA-499及PI3K mRNA表达量、Akt磷酸化活性明显升高，心肌梗死面积明显减少(P<0.05)。心肌组织中PI3K mRNA与microRNA-499的表达量呈正相关(P<0.05)。结论：microRNA-499可能通过激活PI3K/Akt信号通路，减轻大鼠MIRI。

急性心肌梗死越来越严重地影响人类生命健康[1]，在急性心肌梗死发生后及时采用有效手段再通血管、恢复心肌血流是抢救生命的关键[2]，但是心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)却成为挽救缺血心肌的障碍，因此，减轻MIRI成为急性心肌梗死治疗成功的重要因素。药物治疗在防治MIRI方面的作用有限。目前发现了多种与MIRI有关的microRNA(miRNA)，使得基因治疗或将成为MIRI防治的新手段[3]。MiRNA-499是一种有心肌保护作用的微小RNA[4]，但其保护机制尚不明确。PI3K/Akt信号通路是一种在急性心肌缺血后能够起到心脏保护作用的信号通道[5]，并且已发现[6-7]有其他miRNA通过激活PI3K/Akt通路而发挥心脏保护作用。该研究旨在揭示miRNA-499的心脏保护作用与PI3K/Akt通路的关系。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 清洁级SD大鼠30只，体重220～280 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2012-0001。戊巴比妥钠(北京索莱宝科技有限公司)；miRNA-499激动剂(百奥迈科生物技术有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ、DL2000 DNA Marker(TaKaRa)；miRcute miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒均购于北京天根生化科技有限公司；山羊抗兔IgG(H+L)、山羊抗小鼠IgG(H+L)购于北京天德悦生物科技有限责任公司；GAPDH鼠单抗(美国Immunoway公司)。

1.2 实验分组及方法 30只大鼠随机分为3组，每组10只。假手术组：大鼠开胸后仅在冠状动脉左前降支下穿线但不结扎。模型组：对心脏冠状动脉左前降支实施缺血30 min、再灌注120 min[8]。干预组：大鼠按10 mg/kg尾静脉注射miRNA-499激动剂，48 h后行MIRI手术。每组取5只大鼠于再灌注结束时迅速摘取心脏组织并用预冷的无菌生理盐水充分冲洗心脏内外的血液，剪去多余部分,只保留左心室区域，迅速放置于无菌无热源冻存管内，液氮罐中速冻，随后置于-80 ℃冰箱中保存，备检PI3K mRNA、miRNA-499及Akt蛋白磷酸化活性。每组余5只大鼠于再灌注末摘取整个心脏后用生理盐水冲洗，随后用滤纸吸干其表面的水分，将整个心脏快速放入-20 ℃冰箱，备检心肌梗死面积(IS)。

1.3 心肌组织中PI3K mRNA、miRNA-499的检测

采用荧光定量RT-PCR法检测。PI3K上游引物:5’-CAAGGAAAAATGCCCTATTGAAGAA-3’，下游引物：5’-TGTGCCTGTCACCTATCCCAAGA-3’；内参GAPDH上游引物:5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物：5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。miRNA-499上游引物：5’-TTAAGACTTGCAGTGAT GTTT-3’；内参U6上游引物：5’-CTGCGCAAGGAT GACACGCAAATT-3’。 引物均由Invitrogen公司合成。采用Trizol提取心肌细胞RNA，经Poly(A)加尾，按照试剂盒说明书逆转录得cDNA，再行PCR，PCR反应条件如下。PI3K：95 ℃ 30 s预变性；95 ℃5 s变性；60 ℃40 s(采集SYBR荧光信号)，45个循环。miRNA-499：94 ℃ 2 min预变性；94 ℃ 20 s变性；60 ℃34 s(采集SYBR荧光信号)，45个循环。通过2-ΔΔCt法计算miRNA-499和PI3K mRNA表达量。

1.4 心肌组织中Akt蛋白磷酸化活性的检测 大鼠心肌组织研磨后加入0 ℃RIPA裂解液，加入蛋白酶抑制剂(检测磷酸化蛋白即P-Akt时需同时加入磷酸酶抑制剂)提取蛋白，采用BCA蛋白定量法检测蛋白浓度。以RIPA调整蛋白浓度，配制120 g/L分离胶、50 g/L浓缩胶进行电泳，以孔径为0.45 μm NC膜进行转膜，BSA-TBST封闭30 min，一抗分别为P-Akt兔单抗(12 000)、Akt兔多抗(15 000)、GAPDH鼠单抗(120 000)，孵育10 min，4 ℃过夜，二抗分别为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(H+L)(110 000)或山羊抗小鼠IgG(H+L)(110 000),室温孵育40 min。ECL化学发光法使条带显影，用成像软件扫描胶片并保存图片，用Image J图像分析软件测定条带的灰度值。Akt蛋白磷酸化活性以P-Akt与Akt条带灰度值的比值来表示。

1.5 心肌IS的测定 将整个心脏标本速冻20 min后取出，由心尖至心基底部切取4～5片，片厚2 mm，置入用PBS配制的10 g/L TTC溶液中，37 ℃水浴温孵25 min左右，再放入甲醛溶液中固定10 min，然后于解剖显微镜下观察并分离缺血危险区和心肌梗死区，缺血危险区呈红色，心肌梗死区呈白色。待干燥后，将分离好的心肌组织分别称重。IS=梗死区心肌质量/缺血区心肌质量×100%[9]。

1.6 统计学处理 应用SPSS 19.0处理数据， 3组miRNA-499、PI3K mRNA表达量及Akt蛋白磷酸化活性、IS的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，对PI3K mRNA的表达与miRNA-499的表达进行Pearson相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组心肌组织中PI3K mRNA和miRNA-499表达量的比较 见表1。与假手术组相比，模型组miRNA-499、PI3K mRNA表达量降低，干预组较模型组升高(P<0.05)，其中miRNA-499表达量高于假手术组(P<0.05)。

2.2 3组心肌组织中Akt磷酸化活性的比较 见图1、表1。与假手术组相比，模型组Akt磷酸化活性降低,干预组较模型组和假手术组升高(P<0.05)。

表1 3组大鼠心肌各指标的比较

*：与假手术组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05。

1：假手术组；2：模型组；3：干预组。图1 3组Akt磷酸化活性测定

2.3 3组IS的比较 见图2、表1。与假手术组相比，模型组IS增加;干预组较模型组明显减小(P<0.05)，但仍大于假手术组(P<0.05)。

左：干预组；中：模型组；右：假手术组。图2 各组IS检测

2.4 心肌组织中PI3K mRNA与miRNA-499表达的相关性 Pearson相关分析显示，假手术组、模型组和干预组中PI3K mRNA与miRNA-499的表达量均呈正相关(r=0.774、0.548和0.633，P均<0.05)。

3 讨论

MiRNA是一类大小约22个核苷酸的非编码RNA分子，可通过与靶基因mRNA的特定位点结合,抑制蛋白的合成或诱导该mRNA的降解，从而参与基因的表达调控。miRNA调控着许多细胞进程，包括细胞增殖、分化、凋亡和细胞吞噬[10]。多种与冠心病相关的miRNA例如miRNA-133、miRNA-126、miRNA-21、miRNA-499已经被发现。

MiRNA-499在骨骼肌和心肌组织中表达丰富。Wang等[11]的研究表明miRNA-499在生理状态的心肌中表达量非常高，在MIRI的心肌中表达降低；通过调控miRNA-499的表达可以改善由缺血-再灌注引起的心肌细胞凋亡和心功能的改变。有研究[12-13]表明miRNA-499具有急性心肌梗死早期血浆生物标记物的作用，且循环血中miRNA-499可作为心脏外科手术围手术期心肌梗死的早期诊断指标。该研究中，作者建立了MIRI模型，并用miRNA-499激动剂对模型大鼠进行预处理。结果显示，模型组大鼠心肌组织中miRNA-499的表达量较假手术组明显减少，心肌发生大面积的梗死；而干预组虽也建立了MIRI模型，但因用miRNA-499激动剂预处理，其miRNA-499的表达水平明显高于模型组，甚至高于假手术组，同时干预组大鼠IS较模型组明显降低，与Wang等[11]的研究结果一致，进一步证实了miRNA-499的心脏保护功能。

MIRI时机体会激活多种保护性通道以减轻心脏损伤[14]，PI3K/Akt信号通路便是其中一种，Akt是PI3K的主要下游效应分子[15]。部分miRNA可通过下调PI3K/Akt信号通路中的PETN活性激活Akt磷酸化,从而起到心肌保护作用[16]。该研究结果显示，模型组大鼠心肌组织中PI3K mRNA表达水平和Akt磷酸化活性较假手术组显著降低，而干预组心肌组织中二者均较模型组显著升高，并且Akt磷酸化活性与miRNA-499的表达量呈正相关。这有可能证明miRNA-499通过激活PI3K/Akt信号通路而发挥心脏保护作用。

总之，随着分子和细胞机制的研究越来越丰富和深入，临床基因治疗MIRI的可能性也越来越大[17]，miRNA-499或可成为急性心肌梗死的早期诊断标志和治疗靶点。

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(2016-03-16收稿 责任编辑王 曼)

Effect of microRNA-499 targeted at PI3K/Akt signaling pathway on myocardial ischemia-reperfusion in rats

CUIRuixin,LYUFenghua,YUEYing,LIUYakun,GAOJianzhi

FirstDepartmentofCardiovascularMedicine,theFirstClinicalCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453100

myocardium;ischemia-reperfusion injury;microRNA-499;PI3K;Akt;rat

Aim: To investigate the effect of miRNA-499 on myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI) of rats and its relation with PI3K/Akt signaling pathway. Methods: Thirty SD rats were randomly assigned into sham-operation group, model group, and precondition group with 10 rats in each group. In the sham-operation group, the thread was only threaded under left anterior descending coronary artery(LAD) but not ligated; in model group, MIRI models were built by ligating LAD with 30 min ischemia and 120 min reperfusion; in the precondition group, rats were injected miRNA-499 agomir 48 h before MIRI operation. Real Time RT-PCR was adopted to detect the expressions of miRNA-499 and PI3K mRNA, Western blot was adopted to detect Akt phosphorylation level, and the myocardial infarction size were measured using TTC staining. Results: Compared with sham-operation group, the expressions of miRNA-499 and PI3K mRNA, and the Akt phosphorylation level in model group were significantly lower,and the infarction size were larger(P<0.05). Compared with those in MIRI group, the expressions of miRNA-499 and PI3K mRNA, and the Akt phosphorylation level in precondition group were obviously higher,while the infarction size was smaller(P<0.05). The expression of microRNA-499 was positively related to that of PI3K mRNA(P<0.05)。Conclusion: microRNA-499 could reduce MIRI via activating the PI3K/Akt signaling pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.013

R542.2

*河南省高等学校青年骨干教师资助计划 2009GGJS-085