针刀松解法对膝骨性关节炎兔软骨基质金属蛋白酶-3和Ⅱ型胶原蛋白表达的影响

肖红



针刀松解法对膝骨性关节炎兔软骨基质金属蛋白酶-3和Ⅱ型胶原蛋白表达的影响

肖红

(石家庄市第一医院,石家庄 050011)

目的 观察针刀松解法对膝骨关节炎(KOA)兔软骨基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)的影响,探讨针刀治疗KOA的机制。方法 将40只清洁级6月龄健康新西兰兔随机取10只为空白组,剩余30只统一造模,关节制动方法制造KOA模型,造模成功后将30只兔随机分为模型组、针刀组和电针组,每组10只。针刀组以膝关节内外侧副韧带及髌韧带为松解对象,以纵疏、横剥法进行针刀松解,每星期1次,共治疗3次;电针组取阴陵泉、阳陵泉、内膝眼、犊鼻穴,电针频率2～100 Hz,强度为3 mA,每次电针20 min,每星期治疗3次,共治疗3星期。光镜观察软骨形态改变,Western blot法检测膝关节软骨Col-Ⅱ、MMP-3蛋白表达水平。结果 HE染色模型组家兔膝关节滑膜存在不同程度增生、水肿,光镜下见模型组关节软骨呈明显退行性变。电针组和针刀组软骨组织损伤减轻,且有修复趋势。针刀组兔膝关节软骨破坏程度明显减轻。针刀组Col-Ⅱ蛋白表达较模型组明显升高(＜0.01);针刀组Col-Ⅱ蛋白表达与电针组比较,差异具有统计学意义(＜0.05);模型组Col-Ⅱ蛋白表达水平降低,与其他各组比较差异均有统计学意义(＜0.05)。模型组MMP-3蛋白表达较空白组明显升高 (＜0.01);针刀组MMP-3蛋白表达较空白组降低,但无统计学意义(＞0.05);针刀组MMP-3蛋白表达与模型组和电针组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。结论 针刀松解治疗KOA兔,能够使软骨MMP-3水平下降,Col-Ⅱ表达水平升高,从而阻抑软骨退变,起到治疗作用。

针刺疗法;小针刀;电针;骨关节炎,膝关节;兔;基质金属蛋白酶-3;二型胶原

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种退行性骨关节病,为中老年常见病、多发病。膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)由于膝关节负重量与活动量较大,因此也是OA最常见的一种,一般保守治疗较难治愈,且易复发。KOA以关节软骨退行性改变甚至消失为主要病理特征[1]。目前OA的病因尚不明确,但具有相似的生物学、形态学和临床特征。随着老龄化社会的到来,OA患者数量将逐渐升高。骨关节炎危害较大,一直是骨科科学研究的重要课题。虽然在OA的早期治疗和抑制其发展方向的投入较大,但在过去20年里,药物治疗方面并未取得长足的进步[2]。

针刀作为一种中医学新的微创技术,在KOA的治疗方面取得了较好的疗效,但基础研究尚待深入。本研究试图通过观察实验过程中软骨Col-Ⅱ、MMP-3蛋白表达情况来探讨针刀治疗KOA的可能机制,为临床治疗KOA提供理论依据,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康清洁级6月龄新西兰兔40只,雌雄各半,体重为(2.25±0.25)kg。由北京市昌平区金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供(动物合格证号SCXK京2010- 0001),实验期间单笼饲养。取10只为空白组,剩余30只统一造模,在造模6星期后,随机分为模型组、电针组和针刀组,每组10只。实验室室温恒定,为23℃～25℃,湿度为60%,紫外线定期消毒。动物自由摄食饮水,采用标准饲料。

1.2 试剂与仪器

固定树脂绷带(15 cm×180 cm,珠海丽珠医用生物材料有限公司);针刀(0.40 mm×40 mm,北京卓越华友医疗器械有限公司);环球牌毫针(0.20 mm×13 mm,苏州针灸用品有限公司);HANS穴位神经刺激仪(LH 202H型,北京华卫产业开发公司)。

乙醇(北京民生药业有限公司);苏木素伊红染色试剂(北京化学试剂公司);二甲苯(北京北化化学品有限责任公司);石蜡(北京化学试剂公司);ZD-9556水平摇床(江苏太仓市实验设备厂);光学显微镜(日本Nikon株式会社);切片机(FS/FAS5030石蜡切片机,德国LETIZ公司),稳压稳流电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 造模及模型评价

除空白组外,剩余3组动物均采用改良后Vidman法[3](即左后肢伸直位固定制动法)制备KOA模型。具体方法为,将动物牵拉,使其处于完全伸直位,树脂绷带经65℃～85℃热水浸泡软化后,从腹股沟到脚踝予以固定(膝关节伸直180°),留出足趾观察血供,共制动6星期。制动满6星期时,从各组动物中随机抽取2只拍摄X线片,结合影像学、形态学及行为学测评结果,示造模成功后,将所有动物树脂固定拆除。在整个造模过程中,若出现足底溃烂、足底咬伤、骨折、皮肤感染、腹泻等情况,均予以剔除。

1.4 治疗方法

针刀组造模1星期后,以兔膝关节的内、外侧副韧带及髌韧带为进针刀点。先用龙胆紫定位,备皮消毒后,再刺入针刀,内、外侧副韧带操作时,于韧带中点前缘进针刀,刀口线与韧带走向平行,刀体垂直皮肤刺入后,向韧带起、止点方向松解；髌韧带操作时,刀口线与髌韧带走向平行,刀体垂直髌韧带皮肤剌入后,由上而下松解。以上进针刀部位,分别施以纵疏横剥离等手法进行操作,出针刀后加压片刻。1星期治疗1次,共治疗3星期。

电针组取阳陵泉、阴陵泉、内膝眼、犊鼻。以韩氏电针仪行电针刺激治疗。强度为3 mA,频率为2～100 Hz,采用疏密波形,每次20 min。隔日治疗1次,每星期治疗3次,共治疗3星期。

空白组正常饲养,不做任何干预。

模型组造模后正常饲养,不做任何干预。

1.5 取材及指标检测

所有动物在治疗结束1星期后,采用空气栓塞法处死并进行取材。超净工作台上,用手术刀快速切取股骨外侧髁2 cm×2 cm大小的新鲜软骨,一部分标本立即投入10%福尔马林溶液中固定1星期,先用5%硝酸溶液脱钙,约15 d后取矢状面,常规步骤处理后石蜡包埋,切片,片厚约5mm,HE染色后光镜下观察。另一部分标本置于塑料试管内,封盖,﹣80℃冷冻,用于Western blot检测。

1.6 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行数据统计分析,所得数据以均数±标准差表示。先进行正态性与方差齐性检验,满足条件的组间比较采用单因素方差分析(-)。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 关节软骨光镜观察结果

由图1可见,空白组膝关节软骨结构正常,软骨表面光滑,厚度正常,软骨细胞排列整齐有序,分层清楚,软骨基质均匀,潮线较清晰完整。模型组关节软骨层表面不光滑,完整性破坏,厚薄不一,有的可见软骨层裂隙,部分软骨基质溶解水肿,软骨细胞部分坏死,细胞排列紊乱,软骨下骨裸露,潮线多扭曲不完整,部分区域可见重复潮线。针刀组结构基本正常,血管数量增加,但细胞排列仍见局部紊乱,软骨表层轻度破坏,偶见重复潮线,无血管翳形成。电针组软骨表层细胞坏死、剥脱,深层软骨细胞坏死消失,潮线结构清晰,其下尚可见正常的软骨细胞,无血管翳形成。空白组软骨表面光滑,结构清晰完整;模型组软骨表面不光滑,结构不完整,细胞排列紊乱,潮线扭曲或见双重潮线;针刀组软骨表层较光滑,结构轻度破坏,细胞排列局部紊乱;电针组软骨表层不完整,细胞排列轻度紊乱,无血管翳生成。

图1 各组兔膝关节软骨HE染色光镜观察情况

2.2 针刀松解法对软骨Col-Ⅱ蛋白含量表达的影响

由表1、图2及图3可见,模型组Col-Ⅱ蛋白表达较空白组明显降低,两组比较差异具有统计学意义 (＜0.01);针刀组较空白组降低,两组比较差异具有统计学意义(＜0.01);针刀组较模型组明显升高,两组比较差异具有统计学意义(＜0.01);电针组较空白组明显升高,两组比较差异具有统计学意义(＜0.05);电针组Col-Ⅱ蛋白表达与模型组比较,差异无统计学意义(＞0.05);针刀组Col-Ⅱ蛋白表达与电针组比较,差异有统计学意义(＜0.05)。

表1 各组软骨Col-Ⅱ蛋白表达水平比较 (±s)

表1 各组软骨Col-Ⅱ蛋白表达水平比较 (±s)

组别nCol-Ⅱ蛋白表达量 空白组60.78±0.11 模型组60.31±0.071) 针刀组60.57±0.071)2) 电针组60.46±0.091)2)3)

注:与空白组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01;与针刀组比较3)＜0.05

图2 各组软骨Col-Ⅱ蛋白表达水平比较直方图

图3 各组软骨Col-Ⅱ蛋白Western blot表达

2.3 针刀松解法对软骨MMP-3蛋白的含量表达的影响

由表2、图4及图5可见,模型组MMP-3蛋白表达较空白组明显升高,两组比较差异具有统计学意义 (＜0.01);针刀组较空白组降低,但两组比较差异无统计学意义(＞0.05);针刀组较模型组明显降低,两组比较差异具有统计学意义(＜0.01);电针组较空白组明显升高,两组比较差异具有统计学意义(＜0.01);电针组MMP-3蛋白表达与模型组比较,差异无统计学意义(＞0.05);针刀组MMP-3蛋白表达与电针组比较,差异具有统计学意义(＜0.05)。

表2 各组软骨MMP-3蛋白表达水平比较 (±s)

表2 各组软骨MMP-3蛋白表达水平比较 (±s)

组别n蛋白表达量 空白组60.54±0.11 模型组61.17±0.211) 针刀组60.64±0.061)2) 电针组60.89±0.141)2)3)

注:与空白组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01;与针刀组比较3)＜0.05

图4 各组软骨MMP-3蛋白表达水平比较直方图

图5 各组软骨MMP-3蛋白Western blot

3 讨论

骨关节炎是一种常见于中老年人的慢性、进展性关节疾病,其最典型的病理特征是关节软骨破坏[4]。关节软骨是由软骨细胞和细胞外基质构成的。胶原是关节软骨的主要成分和张力的决定性因素,关节软骨含Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ型胶原等成分,其中Ⅱ型胶原是软骨的主要结构成分[5]。OA的特征是关节软骨的广泛降解,在分子水平上表现为Ⅱ型胶原的断裂,蛋白多糖的丢失[6]。

尽管KOA发病机制不明,病因复杂。近年来研究[7-8]发现,OA关节软骨基质合成与降解失衡是软骨变性的重要因素,软骨细胞外基质的丢失是导致OA与其他炎性关节炎的共同特征。在OA中,合成和分解活动平衡的改变,导致软骨基质成分丢失,关节软骨组成结构和功能发生特异性改变[9]。目前认为,基质金属蛋白酶(MMPs)在OA的发病中起到主要的作用[10],多种基质金属蛋白酶对关节软骨细胞外基质有降解作用,使关节软骨肿胀,最终导致关节软骨进行性破坏,基质Ⅱ型胶原纤维裂解,导致OA形成[11]。MMPs能降解几乎所有的软骨细胞外基质,是降解细胞外基质的主要酶系,在OA发病过程中起重要作用[12]。MMP-3是MMPs家族中的一员,除了能降解大量的细胞外基底膜成分外,还能激活明胶酶、胶原酶和多种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白,并能激活多种MMPs前体(pro-MMPs),在关节软骨和骨的破坏过程中发挥着重要作用[13]。MMP-3除对蛋白多糖有高度的裂解活性外,还激活MMP-1加速胶原的病理性降解[14]。故本研究试图通过观察实验过程中软骨Col-Ⅱ、MMP-3蛋白表达情况来探讨针刀治疗KOA的可能机制。

吴志宏等[15]实验研究光镜下观察OA Ⅲ～Ⅳ期的特点是关节软骨退变已发展至关节软骨全层,潮线和钙化层存在、完整或缺损消失,关节软骨已变薄,软骨细胞明显减少,且大量变性、坏死,这与本实验模型组HE染色光镜观察结果一致。因此,OA的发生发展首先是基质中胶原纤维网的破坏和蛋白多糖的丢失,进而导致软骨细胞的变性和坏死,从软骨的浅层发展到深层,最终出现软骨全层的消失及软骨下骨增生。基质的降解与合成之间的平衡被打破,机体失去了代偿能力,软骨破坏不可逆。国外有学者[16-17]研究发现基质降解后的片段可以进一步加速骨关节炎的进程。Yasuda T等[18]实验研究发现Ⅱ型胶原蛋白的分解片段可以促进软骨细胞中MMPs和细胞因子的表达增高,进而进一步促进Ⅱ型胶原蛋白降解,类似于一个反馈环路。有研究[19]显示Ⅱ型胶原分解后的片段能与多种整合素受体结合来调节Ⅱ型胶原降解。Ⅱ型胶原分解后的片段可促进细胞因子的增加,并推测Ⅱ型胶原分解后的片段作用于某些受体,进而激活了特殊的蛋白激酶,上调如1L-1、NO和TNF的表达,导致了软骨降解的增加。另外,免疫反应在OA的发病机制中起着重要作用。关节软骨代谢后的产物可以引起免疫反应,诱导炎症的产生[20]。

马春辉等[21]通过实验研究发现在OA的发病早期,胶原的降解增加,软骨细胞Ⅱ型胶原表达代偿性增加,胶原降解与合成之间轻度不平衡尚可代偿;OA发病后期,软骨组织失去了代偿能力,软骨细胞Ⅱ型胶原表达下降,软骨破坏进入不可逆阶段。

本实验造模后,模型组膝关节软骨Col-Ⅱ蛋白表达较空白组明显降低,说明在造模6星期时软骨胶原纤维合成减少,基质中胶原纤维网的破坏,基质已发生降解,也进一步从分子生物学角度验证了造模成功;针刀组Col-Ⅱ蛋白表达较模型组明显升高,说明针刀能够上调基质Col-Ⅱ蛋白表达,对软骨有修复保护作用。针刀干预后MMP-3蛋白表达量与模型组相比降低,进而说明针刀可能通过调控基质金属蛋白酶表达来阻抑软骨细胞外基质的降解,抑制炎症,抑制软骨细胞凋亡,延缓软骨损伤与关节退变,针刀对KOA的软骨有保护和促进修复作用[22-25]。针刀在KOA的治疗上具有手术切开和针灸的双重作用,可以切开黏连挛缩、瘢痕,通经活络,调节代谢,改善局部血运,因此作用优于电针。MMPs的降低,意味着软骨中蛋白多糖、胶原的降解减少,关节软骨变性减轻,产生治疗效果[26]。随着人口老龄化的进程,OA的发病率越来越高,寻找OA有效的治疗措施非常重要,针刀治疗KOA效果确切,金属蛋白酶在OA软骨的退化过程中起了重要的作用,理解其作用机理寻找以金属蛋白酶为靶点的治疗方案,进而为OA的治疗开辟新的途径。

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Effect of Acupotomy Lysis on the Expressions of Cartilage Matrix Metalloproteinase-3 and Type Ⅱ Collagen in Rabbits with Knee Osteoarthritis

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,050011,

Objective To investigate the effect of acupotomy lysis on the expressions of cartilage matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) and type Ⅱcollagen (Col-Ⅱ) in rabbits with knee osteoarthritis (KOA). Methods Of 40 6-month-old healthy New Zealand rabbits of clean grade, 10 were randomly selected as a blank group and the other 30 were used for model making. A KOA model was made by joint immobilization. After successful model making, the 30 rabbits were randomized into model, acupotomy and electroacupuncture groups, 10 rabbits each. The acupotomy group received acupotomy lysis of knee lateral collateral ligaments and patellar ligament by longitudinal loosening and transverse stripping, once a week for a total of three times. The electroacupuncture group was given electroacupuncture at points Yinlingquan, Yanglingquan, media Xiyan and Dubi, at a frequency of 2-100 Hz and an intensity of 3 mA, 20 min thrice a week for a total of three weeks. Morphological changes in the cartilage were observed by optical microscopy. The expressions of Col-Ⅱ and MMP-3 in knee cartilage were determined by Western blotting. Results HE staining showed different degrees of hyperplasia and edema of knee joint synovium in the model group of rabbits. Optical microscopy showed an obvious degenerative change in the articular cartilage in the model group. Injury to the cartilage tissue was reduced and had a tendency to be repaired in the electroacupuncture and acupotomy groups. Knee cartilage destruction was significantly reduced in the acupotomy group of rabbits. Col-Ⅱ expression was higher in the acupotomy group than in the model group (＜0.01). There was a statistically significant difference in Col-Ⅱ expression between the acupotomy and electro- acupuncture groups (＜0.05). Col-Ⅱ expression was low in the model group and there was a statistically significant difference compared with the other groups (＜0.05). MMP-3 expression was significantly higher in the model group than in the blank group (＜0.01). MMP-3 expression was lower in the acupotomy group than in the blank group (＜0.01) but there was no statistically significant difference (＞0.05). There was a statistically significant difference in MMP-3 expression between the acupotomy group and the model or electroacupuncture group (＜0.01,＜0.05). Conclusions Acupotomy lysis can reduce cartilage MMP-3 level and increase Col-Ⅱ expression to prevent cartilage degeneration and produce a therapeutic effect in the treatment of KOA rabbits.

Acupuncture therapy; Small needle knife; Electroacupuncture; Osteoarthritis, knee joint; Rabbits; Matrix metalloproteinase-3; Type Ⅱ collagen

1005-0957(2016)11-1353-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.11.1353

2016-05-11

肖红(1980 - ),女