甘蔗黑穗病菌和赤腐病菌双重PCR检测体系的建立

吴伟怀，杨先锋，梁艳琼，汪全伟，郑金龙，郑肖兰，习金根，李锐，张驰成，贺春萍*，易克贤*

（1.农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地—海南省热带作物栽培生理学重点实验室/农业部儋州热带作物科学观测实验站，海南儋州571737；2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带农林有害生物入侵检测与控制重点开放实验室/海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室，海南海口571101；3.中国热带农业科学院科技信息研究所，海南海口571101）

甘蔗黑穗病菌和赤腐病菌双重PCR检测体系的建立

吴伟怀1，2，杨先锋1，梁艳琼2，汪全伟3，郑金龙2，郑肖兰2，习金根2，李锐2，张驰成2，贺春萍2*，易克贤2*

（1.农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地—海南省热带作物栽培生理学重点实验室/农业部儋州热带作物科学观测实验站，海南儋州571737；2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带农林有害生物入侵检测与控制重点开放实验室/海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室，海南海口571101；3.中国热带农业科学院科技信息研究所，海南海口571101）

目前，针对甘蔗黑穗病菌与赤腐病菌单个病菌检测体系已相继建立，但是仍然未见两个病原菌的双重PCR检测方法。在本研究中，根据黑穗病菌交配型bE基因、甘蔗赤腐病菌特异性SCAR片段序列的特异性引物，在二者单一PCR检测体系的基础上，建立并优化可同时检测黑穗病菌和赤腐病菌的双重PCR检测方法。建立的双重PCR检测体系可从黑穗病菌与赤腐病菌样品中分别扩增出320 bp和442 bp的特异条带。灵敏度分析结果表明，对混合模板黑穗病菌与赤腐病菌的最低检测水平量均为0.1ng。

甘蔗黑穗病菌；甘蔗赤腐病菌；双重PCR；检测体系

甘蔗黑穗病与甘蔗赤腐病是我国甘蔗种植区中普遍发生的两种真菌病害。前者由甘蔗鞭黑粉菌Sporisorium scitamineum引起，其典型特征是黑鞭在种植约120d才会出现[1]，而后者则由镰型炭疽菌Colletotrichum falcatum Went引起，二者最初的传播均可通过种茎传播，属于种传播病害。现有研究表明，控制甘蔗黑穗病害比较难，目前主要依靠种植抗病品种、种植无病种茎苗以及结合植物检疫[1-2]。因此，建立病害的灵敏、可靠且高通量的检测技术体系是有必要的。

目前，针对黑穗病菌与赤腐病菌单个病原菌检测体系已相继建立。早在1996年，Albert和Schenck基于Usilago maydis bE交配基因设计了引物对bE4/bE8用于扩增甘蔗黑穗病菌“＋”、“－”交配型单倍体；通过该引物对扩增得到的bE基因区域与Usilago maydis和Ustilago hordei具有70%的同源性。应用这对引物可以从甘蔗组织和甘蔗黑穗病菌双核菌丝体的混合DNA中扩增到目的片段[3]。随后，这对引物被用于从发病甘蔗组织中分离获得的甘蔗黑穗病菌单倍体和双核菌丝体DNA进行扩增，获得了495 bp大小的特异片段，而从酵母状细菌和腐生真菌DNA中没有扩增出目的条带，进一步证明了该对引物能用于该病菌的特异性检测[4]。最近，同样基于bE交配基因序列特异性区域，设计了特异性引物bEQ-F/bEQ-R以及TaqMan探针（bEQ-P），从而成功建立了甘蔗黑穗病菌TaqMan Real-time PCR检测体系，使得其检测灵敏度提高到10 ag（黑穗病菌）以及0.8 ng（甘蔗基因组DNA）[5]。在甘蔗赤腐病菌方面，Nithya等通过RAPD分析来自印度Tamil Nadu不同甘蔗赤腐病菌菌株，鉴定了一个对赤腐病菌特异的RAPD OPE-01标记，该标记可从基因组中扩增出约560bp的序列。基于此序列，设计了1对能从赤腐病菌基因组特异地扩增出大小为442bp的SCAR标记[6]。随后，Chandra等根据这442bp的特异性序列设计了两个外引物以及两个内引物，最终形成了6组LAMP引物，并对其进行了筛选，建立了甘蔗赤腐病菌LAMP检测体系，从而实现了该菌检测的可视化[7]。然而，在实际生产中，这两种病菌往往同时存在，此时，通过单一病原菌的检测技术一一检测则显得很繁琐。为此，本研究拟以黑穗病交配型bE基因、甘蔗赤腐病菌特异性SCAR片段序列特异设计引物，建立二者的双重PCR体系，以期达到高通量、准确、快速的检测。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株本研究所用的甘蔗黑穗病菌菌株收集自广东湛江甘蔗种植地，而甘蔗赤腐病菌株则采自海南澄迈甘蔗种植区（表1）。两个对照菌株甘蔗轮斑病菌菌株采自海南昌江甘蔗地。以上菌株均保存于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。

1.2方法

1.2.1菌丝体收集及基因组DNA的提取利用马铃薯葡萄糖液体培养基对各供试单孢菌株，于28℃，160 r/min摇菌约5d后，对菌丝体进行过滤收集。收集的菌丝体迅速于液氮中研磨，后进行基因组DNA提取。DNA提取采用真菌DNA提取试剂盒（E.Z.N.A Fungal DNA kit，Omega公司，美国）提取，具体实验步骤参考其说明书进行。

1.2.2引物的确定与合成查阅文献，根据已报道的特异引物，并下载其对应靶基因或靶序列。最终从GenBank中下载甘蔗黑穗病菌交配型bE基因的序列（U61290.1）以及甘蔗赤腐病菌特异性SCAR标记序列（JN545852）。根据多重PCR引物设计原则，对各病原菌已有特异性引物进行分析。最终确定用于本研究的甘蔗黑穗病菌引物为CLS 320F/R[8]，用于本研究的甘蔗赤腐病菌的引物为SCAR-F/R[6]。引物序列委托英骏生物技术有限公司采用脱盐纯化方式进行合成（表2）。

1.2.3PCR扩增体系及反应条件基因组单一PCR反应体系为20 μL，其中DNA模板各1μL，10 μL 2× EcoTaq PCR SuperMix，引物总体积为1 μL（10.0 μM），最后以ddH2O补齐。PCR反应在Mastercycler gradient Mastercycler PCR扩增仪上进行，扩增程序为：94℃预变性3 min；随后94℃变性30 s，55℃~64℃退火30 s，72℃延伸40 s，扩增35个循环；最后72℃延伸5 min，20℃保存。PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照相并保存。以单一PCR体系为参考，分别对引物体积（初始浓度均为10.0 μM）以及退火温度两个参数进行优化，引物体积比分别设1∶1、1∶2、2∶1三个体积比，退火温度则分别设55℃、58℃、61℃、64℃四个温度梯度。

1.2.4双重PCR体系的特异性分析选取13个黑穗病菌、8个赤腐病菌菌株，并以甘蔗轮斑病菌与ddH2O作为对照进行PCR特异性验证。

1.2.5双重PCR体系的灵敏度分析用超微量分光光度计（NanoDrop 2000c）分别将甘蔗黑穗病菌与甘蔗赤腐病菌基因组DNA初始浓度调整为100 ng/μL，用ddH2O采用浓度梯度稀释法将两个目标菌DNA依次进行100～109倍的稀释，并各取1μL进行PCR。PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照相并保存。以肉眼可见特异电泳条带所对应的DNA模板浓度，得出单一PCR与双重PCR检测的灵敏度。

表1　 供试菌株Table 1　Isolates used in this study

表2　 靶标基因及特异引物序列

2　结果与分析

2.1双重PCR扩增体系的建立及优化

分别对引物按体积比为1∶1、1∶2、2∶1进行反应体系配制，然后在退火温度按55℃、58℃、61℃、64℃反应条件下分别进行PCR扩增（图1，A、B、C）。实验结果表明，当引物体积比为1∶1，退火温度为55℃时，PCR扩增出来的条带比较均匀且条带清晰，其检测结果与单一PCR扩增结果比较相一致（图1A）。

图1　双重PCR与单一PCR扩增Fig.1 Duplex and single PCR amplification

2.2双重PCR体系的特异性分析

利用已建立的双重PCR扩增体系，分别对两种目标菌以及1种非目标菌进行双重PCR体系的特异性分析。结果表明，在两种目标菌中13个甘蔗黑穗病菌与8个甘蔗赤腐病菌均出现了与预期大小一致的特异性条带，而在非目标菌甘蔗轮斑病菌的两个菌株中均未出现特异性条带（图2）。在阴性对照水中也无任何条带出现（图2）。由此可见，该双重PCR体系具有良好的特异性。

2.3双重PCR体系的灵敏度检测

各取1μL已按10倍递进稀释法稀释过的甘蔗黑穗病菌样品DNA（初始浓度为100 ng/μL）、甘蔗赤腐病菌DNA（初始浓度为100 ng/μL）、以及二者按等体积混合的混合模板进行PCR检测的灵敏度分析。检测结果表明，当稀释倍数为103时，即甘蔗黑穗病菌基因组DNA浓度为0.1 ng/μL，扩增出清晰条带；而在稀释倍数为104时，无可见条带（图3A）。当稀释倍数为103时，即甘蔗赤腐病基因组DNA浓度为0.1 ng/μL，扩增出清晰条带；而在稀释倍数为104时，即甘蔗赤腐病菌基因组DNA浓度为0.01 ng/μL，没有扩增出可见条带（图3B）。由此表明，可以从稀释103倍的甘蔗黑穗病菌、赤腐病菌DNA中检测出清晰条带。而在双重PCR结果中，当稀释103倍时，即甘蔗黑穗病菌、甘蔗赤腐病菌基因组DNA浓度均为0.1 ng/μL时，扩增出清晰条带；而在稀释104倍时，只有微弱的印迹（图3C）。由此可见单一PCR检测与双重PCR检测灵敏度是一致的。所以，用此双重PCR检测体系，在扩增35个循环后，1%琼脂糖凝胶电泳显示最低检测DNA模板水平均为0.1 ng。

图2　双重PCR特异性分析Fig.2 The specificity analysis of the duplex PCR

图3　双重PCR与单一PCR灵敏度比较分析Fig.3 Detection sensitivity comparison between multiplex PCR and mono-PCR

3　讨论

传统上对病原真菌鉴定需要进行病原菌培养，然后根据其病原菌形态、致病性测定以及孢子形态特征等方面进行鉴定，此方法步骤繁琐，耗时费力。随着生物技术的不断发展，许多PCR、多重PCR、Real-time PCR以及近年新发展起来的LAMP技术已广泛用于病原菌的检测。与传统方法相比，这些方法普遍具有快速、灵敏等特点。就甘蔗病害而言，许多研究者将这些方法应用于甘蔗病害的检测，仅甘蔗黑穗病菌交配型bE基因已被不同地区的学者用做PCR检测的靶标基因[3-5，8]。如Chen基于黑穗病菌bE交配型基因序列保守区域设计了一对特异性引物对CLS 320F/CLS 320R，利用该对引物对来自台湾不同甘蔗品种的黑穗病菌进行了分子检测，能从中扩增出一条320bp的条带[8]。此外，PCR检测技术也已广泛应用在甘蔗细菌病害甘蔗宿根矮化病菌、甘蔗花叶病毒PCR检测[9]、甘蔗黄叶病毒PCR检测[9，11]，以及植原体病害甘蔗白叶病菌PCR检测[12-13]、甘蔗草苗病菌PCR检测[14]。总之，一些甘蔗重要病原菌的单一PCR检测技术已初步建立，部分甘蔗病毒病的高通量检测技术体系也已建立[15]。本试验在参考前人的研究结果基础之上[3-5，7-8]，基于黑穗病交配型bE基因、甘蔗赤腐病菌特异性SCAR片段序列保守区域，按照多重PCR引物设计原理，建立了两种常见甘蔗真菌病害快速检测的双重PCR方法。检测结果表明，可从黑穗病菌与赤腐病菌样品中分别扩增出320 bp和442 bp的特异条带。灵敏度分析结果表明，对混合模板中黑穗病菌与赤腐病菌的最低检测水平量均为0.1ng。这一结果与单一检测黑穗病菌与甘蔗赤腐病菌的结果相一致[3，6]。

在多重PCR检测体系中，靶基因的选择至关重要。一般选择一些看家基因。如ITS、beta微管蛋白、肌动蛋白、延长因子、细胞色素氧化酶基因等保守基因的序列特异性分析，从而确定合适的靶标基因。通过分析这些看家基因序列的特异性，从中查询到一些比较特异的区段，设计引物。诚然，这些基因序列并不是总有足够多的变异的位点来区分所有的种。如甘蔗赤腐病菌其靶标序列则是通过RAPD分析来自印度Tamil Nadu不同甘蔗赤腐病菌菌株获得特异性片段，然后再将特异片段转化为SCAR标记[6]。除此之外，引物设计质量直接影响多重PCR的特异性与灵敏度，这些是在建立多重PCR检测体系时值得注意的。

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Establishment of Duplex PCR Detection System for Sporisorium scitamineum and Colletotrichum falcatum from Sugarcane

WU Wei-huai1,2,YANG Xian-feng1,LIANG Yan-qiong2,WANG Quan-wei3,ZHENG Jin-long2, ZHENG Xiao-lan2,XI Jin-gen2,LI Rui2,ZHANG Chi-cheng2,HE Chun-ping2*,YI Ke-xian2*

(1.Opening Project Fund of Key Laboratory of Rubber Biology and Genetic Resource Utilization,Ministry of Agriculture/State Key Laboratory Breeding Base of Cultivation＆Physiology for Tropical Crops/Danzhou Investigation&Experiment Station of Tropical Crops,Ministry of Agriculture,Danzhou,Hainan 571737;2.Environment and Plant Protection Institute,CATAS/Ministry of Agriculture Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests/Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical Agricultural Pests,Haikou,Hainan 571101,China;3.Institute of Scientific and Technical Information CATAS,Haikou,Hainan 571101,China)

At present,the polymerase chain reaction assay have developed for accurate and sensitive detection of smut(Sporisorium scitamineum)and red rot disease（Colletotrichum falcatum）in sugarcane respectively,but duplex PCR detection method of them still did not be established.In the present study,a polymerase chain reaction assay was developed for simultaneous detection of S.scitamineum and C.falcatum using the specific primer pair CLS 320F/R and SCAR F/R based on the bE region of S.scitamineum and the SCAR regions of C. falcatum respectively.The results showed that the 320 bp and 442 bp specific fragment was amplified only from S.scitamineum and C.falcatum,respectively.The detection sensitivity of S.scitamineum and C.falcatum was both 0.1 ng for genomic DNA.

Sporisorium scitamineum;Colletotrichum falcatum；duplex PCR;detection system

S435.661

A

1007－2624（2016）02－0001－04

10.13570/j.cnki.scc.2016.02.001

2016-01-14

中国热带农业科学院橡胶研究所省部重点实验室/科学观测实验站开放课题（RRI-KLOF201506）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2012hzs1J012、2014hzs1J012、2015hzs1J014)。

吴伟怀，男，博士，副研究员；研究方向：植物病理；电话：0898-08986696238；E-mail：weihuaiwu2002@163.com

贺春萍，女，硕士，副研究员；研究方向，植物病理；E-mail：hechunppp@163.com。

易克贤，男，博士，研究员；研究方向：分子抗性育种。E-mail：yikexian@126.com。