黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响*

董雅洁，高维娟，卢锴锋，谢亚芹，朱炎杰（.承德医学院，河北承德　067000；2.河北中医学院）

黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响*

董雅洁1，高维娟2△，卢锴锋1，谢亚芹1，朱炎杰1
（1.承德医学院，河北承德067000；2.河北中医学院）

目的:观察黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。方法：雄性SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注模型组、黄芪注射液溶剂组、黄芪注射液组，采用四血管阻断法建立脑缺血再灌注模型，分别采用免疫组化法和Western blot法检测海马Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达。结果：与假手术组比，模型组Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达明显升高，Bcl-2/Bax明显降低(P＜0.05)；与模型组比，黄芪注射液组Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax明显升高，Bax、Caspase-3蛋白表达明显降低(P＜0.05)。结论：黄芪注射液可通过升高Bcl-2的表达，降低Bax、Caspase-3的表达，抑制脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡。

脑缺血再灌注；黄芪注射液；Bcl-2；Bax；Caspase-3

缺血性脑血管病是神经内科的常见病，缺血后再灌注引起的神经细胞凋亡是造成脑损伤进一步加重的主要原因，Bcl-2和Caspase家族在促进神经元凋亡中起关键作用[1]。本课题组前期研究证实，黄芪注射液可提高原代培养缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Bcl-2的表达，下调Bax的表达，从而抑制海马神经元凋亡[2]。但在体情况下，黄芪注射液是否通过以上靶点发挥抗凋亡作用，尚属未知。本研究通过观察黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的影响，探讨黄芪注射液发挥脑保护作用的具体作用靶点。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂兔抗大鼠Bcl-2多抗、兔抗大鼠Bax单抗、兔抗大鼠Caspase-3单抗、DAB显色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；黄芪注射液，成都地奥制药厂。MK3酶标仪，上海雷勃公司；DYY-6B稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂。

1.2实验动物分组、模型建立及取材SPF级2月龄雄性SD大鼠48只，天津山川红实验动物有限公司，合格证号SCXK（津）2009-001。随机分为四组（n=12）：假手术组、脑缺血再灌注模型组、黄芪注射液溶剂组、黄芪注射液组。除假手术外，其余各组均用四血管阻断法制备模型[3]：大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，颈背侧正中纵切，电凝针烧灼第一颈椎横突翼状孔内的椎动脉；颈前纵切，分离双侧颈总动脉，动脉夹夹闭，0.5h后去除恢复血流，以翻正反射消失作为造模成功标准[4]。假手术组仅行血管分离术。假手术组及模型组于造模前0.5h腹腔注射生理盐水6ml/kg；黄芪注射液组及溶剂组分别用等量黄芪注射液和无菌去离子水代替。各组大鼠均于再灌注后24h取材。

每组随机选取6只大鼠，10%多聚甲醛经心脏灌流固定后取脑，截取视交叉至大脑横裂的脑组织，10%多聚甲醛后固定24h，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5μm。每组剩余的6只大鼠，麻醉后断头取脑，分离海马，-80℃冻存。

1.3免疫组织化学SP法检测海马CA1区神经元Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达取脑组织石蜡切片，采用SP免疫组化法检测目的蛋白的表达，分别滴加一抗（Bcl-2 1:500、Bax 1:300、Caspase-3 1:500），以PBS代替一抗做为阴性对照，DAB显色。采用Mivnt图像分析系统对阳性结果行半定量分析：每只大鼠随机抽取5张切片，每张切片在高倍镜下（×400）选取海马CA1区3个非连续视野，每个视野计算阳性产物面积占总视野面积的比值，取平均值。

1.4Western blot法检测海马Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达称取海马组织提取总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量。取25μg样品，95℃加热变性，12% SDS-PAGE电泳分离，半干电转移法转移到PVDF膜，5%奶粉液封闭2h，加入Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗（稀释倍数同SP法），4℃过夜。加入二抗（1：5000），孵育1h后，用化学发光法显色。以β-actin为内参。胶片经扫描后，用Quantity One 软件对蛋白条带进行定量分析，计算目的蛋白条带与β-actin条带的灰度比值，作为各目的蛋白的相对表达水平。

1.5统计分析使用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理，多组间计量资料的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

与假手术组比，模型组大鼠海马Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达明显升高，Bcl-2/Bax明显降低(P＜0.05)；与模型组相比，黄芪注射液组大鼠海马Bcl-2蛋白的表达、Bcl-2/Bax明显升高，Bax、Caspase-3蛋白的表达明显降低(P＜0.05)。见附表：

附表　黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响（，n=6）

附表　黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响（，n=6）

与假手术组相比：△P＜0.05；与模型组比：*P＜0.05

假手术组　模型组　溶剂对照组 黄芪注射液组免疫组化染色Bcl-2　0.380±0.062 0.521±0.090△0.542±0.084 0.597±0.791*Bax　0.446±0.078 0.798±0.046△0.804±0.048 0.695±0.037*Bcl-2/Bax　0.863±0.036 0.662±0.047△0.685±0.039 0.846±0.052*Caspase-3 0.339±0.049 0.659±0.031△0.651±0.057 0.542±0.061*Western blot法Bcl-2　0.382±0.061 0.542±0.052△0.558±0.030 0.601±0.046*Bax　0.402±0.042 0.795±0.061△0.808±0.054 0.709±0.033*Bcl-2/Bax　0.935±0.041 0.662±0.035△0.683±0.047 0.844±0.038*Caspase-3 0.435±0.049 0.788±0.032△0.791±0.045 0.577±0.031*

3　讨论

脑缺血再灌注损伤过程中细胞凋亡是导致缺血性脑血管病死亡率增高的主要原因。Bcl-2家族是线粒体信号转导通路中重要的调控基因，家族成员间的相互作用在神经细胞的凋亡中起重要作用。抗凋亡成员的代表Bcl-2主要定位于线粒体膜，促凋亡成员的代表Bax主要位于胞质中，正常情况下二者比例恒定，当受到凋亡信号刺激后，两蛋白含量发生变化，决定细胞的生命走向[5]。研究表明[6-8]，上调Bcl-2的表达，可抑制Bax的作用，起抗凋亡作用，而沉默Bcl-2基因，Bax/Bax同源二聚体增多，Caspase凋亡级联反应程序启动，发生细胞凋亡。

黄芪注射液中含皂苷、多糖、氨基酸等多种有效成分，生理活性多样，研究发现其具有强心、利尿、扩血管、抗自由基损伤以及抑制神经元凋亡等多种药理作用[9]。

本研究采用四血管阻断法建立大鼠脑缺血再灌注模型，观察黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。结果显示，脑缺血再灌注损伤后海马Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达明显升高，但Bcl-2 /Bax比值明显下降；与模型组相比，黄芪注射液组Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax比值明显升高，Bax、Caspase-3蛋白表达明显降低。本研究结果提示，海马神经元在缺血再灌注刺激后，凋亡信号开始启动，Bcl-2、Bax均升高，但Bax占据优势，因而有利于在线粒体膜上形成通透性孔道，进而导致凋亡执行蛋白酶Caspase-3活化，发生细胞凋亡[10]。黄芪注射液可通过提高Bcl-2的表达、降低Bax表达，进而使Bcl-2/Bax比值升高，阻止Bax孔道形成，使细胞免于凋亡。因此推测，黄芪注射液可能是以Bcl-2、Bax为靶点进而抑制Caspase-3表达，从而发挥抗凋亡作用。

[1]韦韦，李晓红.脑缺血再灌注损伤与即早基因表达的研究进展[J].中国体外循环杂志，2011，9(2)：125-128.

[2]焦俊霞，高维娟，李玉明，等.黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Bcl-2和Bax表达的影响[J].中国病理生理杂志，2011，27(5)：905-910.

[3]Toda S, Ikeda Y, Teramoto A, et al. Highly reproducible rat model of reversible forebrain ischemia-modified four-vessel occlusion model and its metabolic feature[J]. Acta Neurochir, 2002, 144(12)∶1297-1304.

[4]阳生光，苏科，涂燕喜，等.改良式大鼠全脑缺血再灌注模型的制作及海马回核因子-κ B的表达研究[J].中国全科医学，2010，13(6)：2007-2009.

[5]Βurguillos MA, Hajji N, Englund E, et al. Apoptosis-inducing factor mediates dopaminergic cell death in response to LPS-induced inflammatory stimulus∶ evidence in Parkinson’s disease patients[J].Neurobiol Dis, 2011, 41(1)∶ 177-188.

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[10]Βrahmbhatt H, Oppermann S, Osterlund EJ, et al. Molecular Pathways∶ Leveraging the ΒCL-2 Interactome to Kill Cancer Cells-Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization and Βeyond[J]. Clin Cancer Res, 2015, 21(12)∶ 2671-2676.

EFFECTS OF ASTRAGALUS INJECTION ON BCL-2, BAX AND CASPASE-3 EXPRESSION IN HIPPOCAMPUS OF CEREBRAL ISCHEMIA REPERFUSION RATS

DONG Ya-jie, GAO Wei-juan, LU Kai-feng, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective∶ To investigate the effects of astragalus injection on Βcl-2, Βax and Caspase-3 expression in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats. Methods: Male SD rats were randomly divided into sham-operation group, cerebral ischemia reperfusion model group, astragalus injection solvent group and astragalus injection group. Four-vessel occlusion was used to establish cerebral ischemia reperfusion rats’ model. Immunohistochemical stain and Western blot was used to detect Βcl-2, Βax and Caspase-3 expression in hippocampus. Results: Compared with sham-operation group, Βcl-2, Βax and Caspase-3 expression of rats in model group increased obviously, but Βcl-2/Βax decreased obviously (P＜0.05). Compared with model group, Βcl-2 and Βcl-2/Βax of rats in astragalus injection group increased obviously, but Βax and Caspased-3 decreased obviously (P＜0.05). Conclusions: Astragalus injection can inhibit neuronal apoptosis in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats by up regulating Βcl-2 expression and down regulating Βax, Caspase-3 expression.

Cerebral ischemia reperfusion; Astragalus injection; Βcl-2; Βax; Caspase-3

R285.5

A

1004-6879（2016）06-0453-03

* 河北省科技支撑计划项目（13272504D），河北省教育厅青年基金项目（Q2012002），河北省高校重点学科建设项目资助（冀教高【2013】4号病理学与病理生理学）

△

（2016-05-13）