脂肪源性干细胞对大鼠坐骨神经功能恢复的影响*

付秀美，王荣良，杨海艳，杨振江，付文亮（.承德医学院人体解剖学教研室，河北承德　067000；.承德市妇幼保健院；.承德市中医院）

脂肪源性干细胞对大鼠坐骨神经功能恢复的影响*

付秀美1，王荣良2，杨海艳3，杨振江1，付文亮1
（1.承德医学院人体解剖学教研室，河北承德067000；2.承德市妇幼保健院；3.承德市中医院）

目的:探讨脂肪源性干细胞（ADSCs）对大鼠坐骨神经功能恢复的影响。方法：将第4代ADSCs移植入脱细胞神经移植物（ANA）中，构建组织工程神经。大鼠随机分为正常对照组、培养基组和实验组，培养基组和实验组均建立坐骨神经损伤模型，然后用相应的组织工程神经桥接损伤神经的断端。术后6W和12W采用神经电生理记录仪检测各组大鼠坐骨神经传导速度和波幅。结果：术后6W、12W，实验组坐骨神经传导速度和波幅明显高于培养基组（P＜0.05），但低于正常对照组（P＜0.01）；并且，实验组术后12W时的神经传导速度和波幅明显高于术后6W（P＜0.05）。结论：ADSCs可增加坐骨神经传导速度和波幅，促进坐骨神经功能的恢复。

脂肪源性干细胞；大鼠；坐骨神经；神经传导速度；波幅

目前，周围神经损伤的发生率呈逐年增高的趋势，自体神经移植仍是临床上修复神经缺损的“金标准”，但存在供体选择受限、供区失神经支配及痛性神经瘤等并发症[1]。组织工程学的发展为治疗周围神经缺损提供了新策略。脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是从成体脂肪组织中分离的具有多向分化潜能的成体干细胞，具有来源广泛、取材方便、干细胞含量高、体外可迅速扩增的特点[2]。本课题组前期制备了脱细胞神经移植物（acellular nerve allografts，ANA），且证明ANA可作为神经移植中的桥接支架[3]。本研究以ADSCs为种子细胞、ANA为支架构建组织工程神经，桥接损伤的坐骨神经，通过检测坐骨神经传导速度和波幅的变化，探讨ADSCs对大鼠坐骨神经功能恢复的影响。

1　材料与方法

1.1实验材料I型胶原酶、0.25%胰酶-EDTA（Invitrogen），DMEM/F12培养基（Genview），胎牛血清（BI），脱氧胆酸钠、Triton X-100（Sigma）。雄性Wistar大鼠（购自中国医科大学实验动物部，合格证号：SYXK Liao 2013-0001），体质量200-250g。

1.2实验动物和分组取18只大鼠随机分为正常对照组、培养基组（ANA内单纯注射培养基）和实验组（ANA内注射ADSCs悬液）（每组6只，每个时间点3只）。培养基组和实验组均建立坐骨神经损伤模型，后用相应的组织工程神经桥接于损伤神经的两断端。

1.3制备ANA另取9只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，无菌条件下切取双侧坐骨神经，长约15mm；坐骨神经蒸馏水浸浴12h；4.0%T riton X-100消化12h；蒸馏水漂洗3h；3%脱氧胆酸钠摇床振荡12h（100次/min）；蒸馏水漂洗后置于含有抗生素的PBS中备用。

1.4ADSCs的分离、培养雄性Wistar大鼠，体质量80-100g。无菌条件下切取附睾旁脂肪组织、剪碎；0.1% I型胶原酶37℃消化45-60min；过滤后加入等量含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基终止消化，1200rpm离心15min；重新悬浮细胞、过滤、离心，再次重悬细胞；最后用含有FBS的DMEM/F12培养液制成单细胞悬液，接种于培养瓶中，37℃、5%C O2培养箱内培养。2d后第一次换液，以后根据细胞生长情况每2-3d换液一次。待贴壁细胞铺满瓶底80%时，消化后按1：2传代培养。

1.5检测坐骨神经传导速度和波幅术后6W和12W采用神经电生理记录仪检测坐骨神经传导速度和波幅。刺激强度为1-20mA、时间为0.1-0.2ms、频率为lHz。记录方法：大鼠麻醉，切断梨状肌，充分暴露坐骨神经近端，向下至腓总神经入肌点处。将钩形银针电极分别置于桥接支架的近端和远端，近端刺激，远端记录，应用精度0.2mm的游标卡尺测量两电极间的距离，测定神经传导速度和波幅。

2　结果

2.1ADSCs的分离培养原代ADSCs接种4-6h开始贴壁，24h后大多数细胞均已贴壁生长，倒置显微镜下观察细胞为短梭形、多边形（附图A）。1W后，镜下可见大量成纤维细胞样细胞生长且细胞排列有一定方向性，呈簇状或漩涡状（附图B）。

附图　ADSCs 的原代培养

2.2坐骨神经传导速度和波幅术后6W，实验组坐骨神经传导速度和波幅明显高于培养基组（P＜0.05），但明显低于正常对照组（P＜0.01）。术后12W的变化趋势同术后6W；且实验组术后12W时的神经传导速度和波幅明显高于术后6W（P＜0.05）。见附表：

附表　各组大鼠坐骨神经传导速度和波幅（，n=3）

附表　各组大鼠坐骨神经传导速度和波幅（，n=3）

与实验组比较：aP＜0.01，bP＜0.05；与本组6W比较：cP＜0.05

对照组　神经传导速度　波幅6W　12W　6W　12W正常对照组　10.00±0.00a　10.00±0.00a　9.48±0.54a　9.51±0.52a培养基组　2.95±0.66b　3.15±0.83b　2.07±0.57b　2.17±0.48b实验组　4.04±0.74　4.66±0.93c　3.16±0.36　3.63±0.59c

3　讨论

周围神经损伤后的再生修复一直是临床外科的难题，较小的神经缺损可作端-端缝合，较大的缺损则需用移植物代替桥接。但后者存在很多弊端，如需进行多次手术、供体部位失神经支配及神经瘤形成等[4]。目前，神经组织工程学发展为治疗周围神经损伤提供了新的方法。理想的移植细胞应该具有取材容易、体外扩增迅速以及低免疫源性并能成功与宿主融合。ADSCs来源于成体脂肪组织，具有取材方便、损伤小、干细胞获得量大、适合自体移植且易于被患者接受等特点[5]。因此，ADSCs在细胞移植和组织工程等领域具有明显的优越性。本研究中的ADSCs取自于大鼠附睾旁脂肪组织，该部位ADSCs的生长速度较大鼠颈后、腹股沟、背部、大网膜及肾周等部位快，同时由于表面覆有包膜，污染几率小，纯度较高，是获取ADSCs的较好部位[6]。

神经的生物电传导是周围神经的基本功能。周围神经离断后导致神经传导功能丧失，神经再生后传导功能逐步恢复。有研究提示，神经传导速度和动作电位波幅的增加可反应再生神经纤维数目的增多，因此神经传导功能可作为判断神经损伤和再生的一项可靠指标[7]。本研究发现，与培养基组比较，实验组坐骨神经传导速度明显增加、动作电位波幅明显增大，说明加用ADSCs的实验组大鼠坐骨神经再生情况明显优于培养基组。并且，实验组大鼠术后12W神经电生理参数的改善效果明显优于术后6W，提示随时间的延长效果明显增强。但关于实验组ADSCs促进坐骨神经功能恢复的作用机制，是否来源于移植细胞所分泌的相关神经营养因子，有待进一步的研究。

[1]Βoecker AH, van Neerven SG, Scheffel J, et al. Pre-differentiation of mesenchymal stromal cells in combination with a microstructured nerve guide supports peripheral nerve regeneration in the rat sciatic nerve model[J]. Eur J Neurosci, 2016, 43(3)∶ 404-416.

[2]Fu X, Tong Z, Li Q, et al. Induction of adipose-derived stem cells into Schwann-like cells and observation of Schwann-like cell proliferation[J]. Mol Med Rep, 2016, 14(2)∶1187-1193.

[3]佟晓杰，张彩顺，曹德寿，等.脱细胞异体神经移植物桥接大鼠坐骨神经缺损促进神经-肌接头结构重建和功能恢复的实验研究[J].解剖学报，2005，36（1）：1-5.

[4]Liu G, Cheng Y, Guo S, et al. Transplantation of adipose-derived stem cells for peripheral nerve repair[J].Int J Mol Med, 2011,28 (4)∶565-572.

[5]Βoeloni JN, Ocarino NM, Serakides R. Comparative study of osteogenic differentiation potential of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and adipose tissue of osteoporotic female rats[J]. Connect Tissue Res, 2014, 55(2)∶ 103-114.

[6]Razavi S, Mardani M, Kazemi M, et al. Effect of leukemia inhibitory factor on the myelinogenic ability of Schwann-like cells induced from human adipose-derived stem cells[J]. Cell Mol Neurobiol, 2013, 33(2)∶ 283-289.

[7]Mekaj AY, Morina AA, Manxhuka-Kerliu S, et al. Electrophysiological and functional evaluation of peroneal nerve regeneration in rabbit following topical hyaluronic acid or tacrolimus application after nerve repair[J]. Niger Postgrad Med J, 2015, 22(3)∶ 179-184.

EFFECTS OF ADIPOSE DERIVED STEM CELLS ON FUNCTIONAL RECOVERY OF SCIATIC NERVEIN RATS

FU Xiu-mei, WANG Rong-liang, YANG Hai-yan, et al
(Department of Human Anatomy, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate the effects of adipose derived stem cells (ADSCs) on functional recovery of sciatic nerve in rats. Methods: The 4thgeneration ADSCs were transplanted into the acellular nerve allograft (ANA) to construct the tissue engineering nerves. The rats were randomly divided into normal control group, culture medium group and experimental group. The rats in culture medium group and experimental group were established sciatic nerve injury model, then corresponding tissue engineering nerves were used to bridge the injuried sciatic nerves. 6 and 12 weeks after operation, the sciatic nerve conduction velocity and amplitude were detected by nerve electrophysiology recorder. Results: The sciatic nerve conduction velocity and amplitude of rats in experimental group 6 weeks and 12 weeks after operation were obviously higher than culture medium group (P＜0.05), but obviously lower than normal control group (P＜0.01); Moreover, the sciatic nerve conduction velocity and amplitude of rats in experimental group 12 weeks after operation were obviously higher than that of rats 6 weeks after operation (P＜0.05). Conclusion: ADSCs can increase the sciatic nerve conduction velocity and amplitude, so they could promote recovery of sciatic nerve function.

Adipose derived stem cells (ADSCs); Rat; Sciatic nerve; Nerve conduction velocity; Amplitude

R322.85

A

1004-6879（2016）06-0451-03

*河北省教育厅基金项目（QN2014138），河北省重点发展学科“人体解剖与组织胚胎学”建设项目资助

（2016-03-31）