VCA+EA多肽片段联合包被ELISA对血液EBV IgA检测效果的研究

陈明星，廖秀梅，刘万里

(1.广东省龙川县人民医院 517300；2.中山大学附属肿瘤医院，广东广州 510060)



·论 著·

VCA+EA多肽片段联合包被ELISA对血液EBV IgA检测效果的研究

陈明星1，廖秀梅1，刘万里2△

(1.广东省龙川县人民医院 517300；2.中山大学附属肿瘤医院，广东广州 510060)

目的 探讨中山大学附属肿瘤医院研制的病毒壳抗原(VCA)+早期抗原(EA) 多肽片段联合包被聚苯乙烯微孔板酶联免疫吸附测定(ELISA)方法对血液中Epstein-Barr病毒(EBV) 免疫球蛋白A(IgA)的检测效果，并将其与进口筛选试剂盒进行比较，最终对VCA+EA多肽片段联合包被ELISA试剂盒性能进行评价。方法 收集鼻咽癌患者血清86例，健康人群血清100例，用ELISA检测血清中IgA的OD值，观察该方法的最低检测限、线性范围、精密度、回收率，同时采用进口的Epstein-Barr病毒持续表达核抗原(EBNA1)+VCA-p18抗原包被ELISA方法进行检测，观察其临床性能。结果 VCA+EA多肽片段联合包被ELISA方法最低检测限为(0.003 4±0.002 6)，血清稀释100倍数(及以上)，其水平与吸光度呈线性关系，阴性标本、弱阳性标本、阳性标本IgA水平的日内变异系数为3.97%、9.76%、9.23%，日间变异变异系数分别为7.56%、10.20%、7.67%。VCA+EA多肽片段联合包被试剂盒与EBNA1+VCA-p18抗原包被试剂盒比较，相关系数为0.926 6；检测鼻咽癌敏感性为88.90%，特异性为77.80%，阳性预测值为80.00%，阴性预测值为87.50%。结论 VCA+EA多肽片段联合检测鼻咽癌有较高敏感性，重复性较好，阴性结果预测较可靠，可作为临床筛查鼻咽癌的新方法。

鼻咽癌； Epstein-Barr病毒； 免疫球蛋白A

鼻咽癌是我国南方常见恶性肿瘤，广东为高发区。其发生、发展与Epstein-Barr病毒(EBV)感染密切相关[1]。检测血清中EBV的某些抗体水平已成为早期诊断鼻咽癌的1种有效手段。目前用于检测鼻咽癌的血清抗体有多种，包括有EBV持续表达核抗原(EBNA1)产生的EBNA1-免疫球蛋白A(IgA)、EBNAl-免疫球蛋白G(IgG)，BamH1Z转录因子Zta产生的Zta-IgA、Zta-IgG和病毒壳抗原(VCA)产生的VCA-IgA、VCA-p18-IgA、 VCA-p18-IgG、gp125-IgA，早期抗原(EA)-IgA[2]，EBV特异性DNA酶(EBV-DNase)抗体，ZEBRA-IgG及近年来新发现的胸苷激酶(TK)抗体等。而检测血清中抗体方法则包括Western Blot、高效液相色谱(HPLC)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，免疫酶染色法(IEA)，光化学发光法等。临床常用ELISA检测患者血清抗体水平。早期诊断鼻咽癌，除检测血清抗体水平外，还可检测血清潜伏蛋白LMP-1、小分子RNA[3]。不过，早期诊断方法虽多，但大多准确度、特异性不高，其他则方法复杂、操作繁琐、进口试剂昂贵，不利于临床实际运用，尤其是卫生设施条件较差的社区卫生医疗机构。因此，需要寻求1种成熟简单、价格低廉的方法。现就中山大学附属肿瘤医院研究的VCA+EA多肽片段联合包被ELISA方法报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 健康人群血液标本100例，收集广东省龙川县人民医院血库献血者；阳性血液标本86例，收集自中山大学附属肿瘤医院经由鼻咽镜和(或)病理诊断为鼻咽癌患者。收集后分装，-20 ℃下保存，避免反复冻融。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 采用Thermo Labsystems MK3酶标仪和郑州博赛生物工程有限责任公司生产的Biocell-AW1洗板机，上海跃进医疗器械厂生产的XMT-152A 型37 ℃温育箱。

1.2.2 试剂 由中山大学附属肿瘤医院中心实验室提供磷酸盐吐温缓冲液(PBST)、血清和兔抗人抗体稀释液(1%的PBS-Tween 20，0.1%的牛血清清蛋白，聚乙二醇辛基苯基醚)，辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗人IgA及VCA+EA 多肽片段联合包被酶标板。北京现代高达生物技术有限公司生产的TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)显色液A、B和0.3 mol/L H2SO4终止液(批号为200902001)。EBNA1+VCA-p18进口IgA检测试剂盒购自爱尔兰 Vrije Universiteit Medical Center。

1.3 方法 将1∶100稀释血清100 μL加入VCA+EA多肽片段联合包被ELISA酶标板反应孔内，37 ℃温育1 h，洗涤后加酶标兔抗人IgA 100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤后加显色液TMB A、B液后暗室显色10 min，加终止液，在450 nm主波长和630 nm副波长测定OD值。

2 结 果

2.2 线性试验和线性范围 取混合血清标本，分别做5点倍比稀释(未稀释、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16)。测得平均OD值分别为1.176、0.723、0.587、0.316、0.254，样品稀释度与测定值呈线性关系，得其直线回归方程Y=0.954 5X+0.241 8，r=0.970 9，见图1。通过对血清和稀释液比依次为0∶1、1∶250、1∶200、1∶150、1∶100、10∶90、30∶70、60∶40、80∶10、1∶0等不同水平的系列标准品进行测定，每点各测2次，算得平均OD值分别为：0.463、0.456、0.514、1.194、0.734、0.666 5、0.488 5、0.366、0.499 5、0.011，将吸光度与稀释度绘制成标准曲线，见图2。数据采用最小二乘法原理，采用SPSS13.0统计软件处理，得到在血清稀释100倍(及以上)时血清IgA水平与吸光度呈线性关系。

图1 线性试验水平-吸光度曲线

图2 线性范围试验水平-吸光度曲线

2.3 精密度试验 选取阴性、弱阳性、阳性3例血清标本分别在1 d内重复测试20次，得到日内变异系数分别为3.97%、9.76%、9.23%，见表1。将这3例标本分装在(-20)℃冰箱保存，每天1次，连续5 d检测这3例标本，得到日间变异系数为7.56%、10.20%、7.67%，见表2[5]。

表1 日内变异系数测试结果

表2 日间变异变异系数测试结果

2.4 回收试验 取高OD值和低OD值标本各一例制成混合血清标本，测得混合血清IgA的OD值为0.392[5]，而 IgA标准溶液的OD值为1.02，作4点回收：第1点，混合血清+等体积稀释液；第2点，混合血清+等体积原倍标准液；第3点，混合血清+(1∶2)倍稀释等体积标准液；第4点，混合血清+(1∶4)倍稀释等体积标准液。使其理论OD值分别为0.196，0.706，0.451，0.323 5。测定值分别为0.198，0.71，0.46，0.305，得到IgA回收率分别为100.78%，103.52%，85.49%，平均为96.6%。

2.5 对比试验 随机选取正常和异常血清标本各72例(共144例)，分别采用EBNA1+EB-VCA-p18联合包被ELISA微孔板和VCA+EA 多肽片段联合包被ELISA微孔板，检测标本血清中IgA水平的OD值，并将2种方法的测定结果进行比较，得到线性方程Y=0.914 2X，和r=0.959 6。2种方法测定的OD值经统计软件SPSS13.0计算整理、比较结果[6]，见表3。将数据分为NPC患者和健康人群2组制作箱图，结果表明，2种方法中鼻咽癌患者和健康人群的中位数差距比较显著，阴、阳性判断可靠性较好；2组中位数上下25%不相交，可认为VCA+EA 多肽片段联合包被ELISA方法可用于疾病诊断。

表3 2种方法OD值比较

2.6 2种方法临床性能比较 随机选取正常和异常血清标本各72例(共144例)，分别采用EBNA1+EB-VCA-p18联合包被ELISA微孔板和VCA+EA 多肽片段联合包被ELISA微孔板检测。结果采用SPSS13.0软件分析。绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，通过曲线下面积(AUC)计算Cut-off值及2种方法的敏感性、特异性。VCA+EA多肽片段联合包被ELISA方法Cut-off值为0.242，敏感性为88.90%，特异性为77.80%。EBNA1+EB-VCA-p18联合包被ELISA方法Cut-off值为0.215，敏感性为88.90%，特异性为80.60%[7]。EBN1+EB-VCA-p18联合包被ELISA方法的阳性预测值(PPV)为83.12%，阴性预测值(NPV)为88.60%。 VCA+EA 多肽片段联合包被ELISA方法的PPV为80.00%，NPV为87.50%。见表4。

表4 2种方法临床性能比较(%)

3 讨 论

EBV是1种嗜B细胞的人类疱疹病毒，主要侵犯B细胞，对人体B淋巴细胞亲和力高。人类受EBV感染十分普遍，但仅有极少数个体发生恶性肿瘤，且EBV感染个体不论有否发生恶性肿瘤均可产生一系列抗体[8]。EBV与鼻咽癌关系密切，目前常规采用的EBV血清学检查项目VCA-IgA和EA-IgA仍是鼻咽癌患者临床筛查、辅助诊断及疗效判断的观察指标。而血浆中的DNA测定在临床分型和鼻咽癌疗效检测方面比VCA-IgA和EA-IgA更有价值，特异性和敏感性更高[9]。但是，单纯定性地测定血浆中的DNA意义不大，半定量测定DNA需要昂贵的仪器和试剂，对实验室要求高。所以，需要在免疫学上寻找EBV特异性抗原及其抗体的不同检测方法，降低成本，提高临床性能。

通过对VCA+EA多肽片段联合包被ELISA方法的研究试验，发现该方法最低检测限与检测系统有关，如包括微孔板孔差、酶标仪稳定性、电压低噪音等。血清IgA水平与吸光度线性相关高度相关，线性相关系数达0.970 9，血清测定线性范围在稀释100倍(及以上)时有较好线性，表明该方法临床采用可行，所需标本量不大。精密度试验显示，VCA+EA多肽片段联合包被ELISA方法的日内变异系数虽在可接受范围内，但日间变异系数存在大于10%的情况，表明其稳定性还需进一步改进及论证。回收试验结果表明，VCA+EA多肽片段联合包被ELISA方法准确度可靠，平均回收率达96.6%。

分别采用EBNA1+EB-VCA-p18联合包被ELISA微孔板和VCA+EA 多肽片段联合包被ELISA微孔板检测140例标本，结果相关系数为0.926 6，t检验显示2种方法差异无统计学意义(P>0.05)，具有可替代性。箱图表明，2种方法中鼻咽癌患者和健康人群的中位数差距比较显著，阴、阳性判断可靠性较好；2组中位数上下25%不相交，可认为VCA+EA 多肽片段联合包被ELISA方法可用于疾病诊断。

从临床效能ROC曲线分析，EBNA1+EB-VCA-p18联合包被ELISA方法Cut-off值(0.215)小于VCA+EA 多肽片段联合包被ELISA方法(0.242)，2种方法的敏感性均为88.90%，表明2种方法诊断能力相当；特异性方面，VCA+EA 多肽片段联合包被ELISA方法(77.80%)小于EBNA1+EB-VCA-p18联合包被ELISA方法(80.60%)，提示前者鉴别未患NPC能力稍弱。VCA+EA 多肽片段联合包被ELISA方法PPV、NPV都高于80%，表明其鉴别能力较好。VCA+EA 多肽片段联合包被ELISA方法的4个指标均小于EBNA1+EB-VCA-p18联合包被ELISA方法，表明前者与后者存在一定差距；且其低于Fachiroh等[10]报道的数据，表明其还有改进的空间。从探索新方法检测血清中IgA水平上看，VCA+EA多肽片段联合包被ELISA方法的敏感性和NPV已经可以满足临床疾病筛查。

ELISA发展已久，已成为一项成熟检测工艺，其检测血液中的抗原(抗体)相对比较开放，只要包被不同抗原(抗体)和提供酶标二抗，就可检测标本中相应抗体(抗原)，并可尝试用不同的抗原检测病毒血清抗体[11]，以寻求临床早期诊断和疾病疗效监测的最佳监测条件。VCA+EA多肽片段联合包被ELISA方法作为一种改进方法，可称为提高医疗技术水平的1种新途径。

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Evaluation of double peptides of VCA and EA coated ELISA test in detection of serum EBV IgA

CHENMingxing1,LIAOXiumei1,LIUWanli2△

(1.People′sHospitalofLongchuanCounty,Longchuan,Guangdong517300,China;2.CancerCenterofSunYat-SenUnivercity,Guangzhou,Guangdong510060,China)

Objective To study the value of double peptides of VCA and EA coated ELISA test(EBNA1+ EB-VCA-p18) in serological diagnosis of IgA of Epstein-Barr Viruses(EBV)and to compare the effect with import screening kit.Methods By synthetic peptides EBNA1 and EB-VCA-P18 to establish ELISA assay,serum samples from 86 cases with nasopharyngeal carcinoma and 100 healthy people were collected.And the OD value of IgA was detected.The lowest detectable limit,linearity,precision and recovery were observed.The import ELISA kit of EBV VCA-p18/IgA was used as comparison.Results The lowest detectable limit of this mothed was (0.003 4±0.002 6) after the serum was diluted above 100 times.The level of IgA and absorbance had linear correlation.Daily variation coefficients of the level of IgA in negative samples,weakly positive samples and positive samples were 3.97%,9.76% and 9.23% respectively.Between-day variation coefficients were 7.56%,10.20% and 7.67% respectively.The double peptides of VCA+EA coated ELISA test was positively correlated with EBNA1+EB-VCA-p18 coated ELISA test(r=0.926).The sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value of the test were 88.90%,77.80%,80.00% and 87.50% respectively.Conclusion The double peptides of VCA+EA coated ELISA test has good sensitivity and repeatability,and negative predictive results are reliable,which could be used as a new way to screen nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal carcinoma; Epstein-Barr viruses; IgA

陈明星，男，主管技师，主要从事化学发光免疫学检测和病原微生物方面的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.028

A

1673-4130(2016)21-3024-03

2016-02-03

2016-04-23)