超声破碎辅助蜗牛酶提取杏鲍菇蛋白工艺优化

漆倩涯，贠建民*，黄玉琴，白 杰，张紊玮，艾对元

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

超声破碎辅助蜗牛酶提取杏鲍菇蛋白工艺优化

漆倩涯，贠建民*，黄玉琴，白 杰，张紊玮，艾对元

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

为显著提高杏鲍菇子实体蛋白提取率，采用超声波破碎辅助蜗牛酶水解充分破碎菌体细胞壁。综合应用响应面、正交设计与人工神经网络模型相结合的试验设计方法，分别对超声破碎处理和蜗牛酶水解条件进行了优化，同时与直接热水碱提蛋白法进行了比较。结果表明，超声处理条件为超声功率300 W、超声时间26 min、水料比1.95∶5（mL/g），在此条件下破碎效果最好，提取率达到了48.82%；最佳蜗牛酶水解条件为温度42.8 ℃、pH 4.8、酶用量7%、时间1.5 h，在该条件下蛋白提取率为75.92%，相较热水碱提法提高了33.35%，结果表明利用超声辅助蜗牛酶水解杏鲍菇细胞壁能显著提高蛋白提取率。

杏鲍菇；蛋白；超声破碎法；蜗牛酶；人工神经网络模型

杏鲍菇（Pleurotus eryngii），属真菌门，伞菌目，侧耳属，又名刺芹侧耳[1]。杏鲍菇含有丰富的营养物质，是一种食用价值很高的食用菌[2]，其菌体蛋白质含量高达25.4%，并且富含人体8 种需须氨基酸，精氨酸和谷氨酸的含量甚至与α-酪蛋白、卵蛋白和大豆球蛋白中的含量相近，其中支链氨基酸的含量明显高于芳香族氨基酸的含量[3-4]，已经成为了优质蛋白质的良好原材料和功能肽的制备来源。近年来，以植物性蛋白为原料制备的功能性肽成为国内外研究的热点，如何提高蛋白提取率已成为该工艺技术的关键[5-7]。在杏鲍菇研究方面，国内外多

集中在杏鲍菇多糖提取及功能方面的研究，但是其蛋白质的提取及相关功能肽的制备研究报道较少。

张梦甜等[8]利用纤维素酶破壁提取杏鲍菇蛋白质，并进行了营养评价，证明所得蛋白品质较高。马泽青等[9]利用响应面法超声辅助水提取双孢菇蛋白质，经过优化处理蛋白提取率达到50.39%。杏鲍菇因其子实体细胞壁富含几丁质（壳聚糖）、纤维素等多糖，所以细胞壁较坚韧，胞内蛋白溶出速率受到了很大限制，只有破碎菌体的细胞壁和细胞膜，蛋白释放水平才能得到显著的提升。由于细胞膜弹性强度较差，渗透压的改变易迫使其破碎[10]，所以菌体细胞壁的破碎程度成为了蛋白提取水平的主要制约因素。蜗牛酶是一种混合酶，源自于蜗牛的嗉囊和消化道，能降解几丁质内切酶分解的几丁质产物成单糖，消化腺中发现有纤维素酶、半纤维素酶等，是一种具有很高生物价值的酶[11-12]。陆晨等[13]利用响应面优化超声参数提取茶渣蛋白，经过超声辅助提取蛋白程度高于热水碱提37.2%。张涛等[14]利用蜗牛酶降解壳聚糖，在pH 4、温度40 ℃条件下寡糖收率为64.74%，充分说明蜗牛酶能较好地降解壳聚糖。超声波细胞破碎的原理主要将电能通过换能器转换为声能，声能通过液体介质而变成一个个密集的小气泡，气泡炸裂从而起到破碎细胞等物质的作用，是一种物理方法的破碎效果。酶解法破坏细胞壁的特殊化学键，达到破壁效果，其具有高度专一性，条件温和，一般不会破坏原料物化性质。

本研究拟采用超声波辅助破碎杏鲍菇子实体浆液，并应用响应面法对超声破碎条件进行优化，随后进一步用蜗牛酶水解细胞壁，建立误差反向传播（back propagation，BP）神经网络模型，采用正交设计与神经网络模型相结合的方法优化其酶解条件，最后通过碱提酸沉法提取蛋白，并与单纯热水碱提法进行比较。由于每一种破壁方法都不能达到100%破壁效果，为了使细胞破壁效果达到最佳，故而本实验先采用机械破碎，后使用化学酶解方法。旨在为指导杏鲍菇提取蛋白工艺提供一定的依据和参考，并为杏鲍菇高值产品加工多样化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

棍棒状菌株型杏鲍菇（Pleurotus eryngii）子实体市售；考马斯亮蓝R-250、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、氢氧化钠、95%乙醇溶液等（均为分析纯） 天津市光复科技发展有限公司；蜗牛酶（每克细胞经30～40 mg酶在37 ℃保温1 h即可溶解细胞壁，破壁率90%以上） 上海源叶生物有限公司。

1.2 仪器与设备

JY92-2D超声波细胞粉碎机 上海汗诺仪器有限公司；FA1204B型电子天平、pHS-3C型酸度计 上海佑科仪器仪表有限公司；HHS型电热恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LGJ-0.2型真空冻干实验机兰州科近真空冻干技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杏鲍菇蛋白等电点的测定

将新鲜的杏鲍菇子实体打浆后，用1.0 mol/L NaOH溶液将浆液调节至pH 10浸提1 h后离心，取上清液用pH计调pH 2～5，用考马斯亮蓝法测定上清液中未沉淀的蛋白量确定等电点pI的大致范围[15]。用上述同样方法将上清液调节至等电点范围，用考马斯亮蓝法测定上清液中未沉淀的蛋白量确定等电点pI。

1.3.2 蛋白含量测定

杏鲍菇菌体中蛋白含量的测定采用凯氏定氮法，参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》。

处理液中蛋白含量采用考马斯亮蓝法G-250法[16]测定。以1 mL双蒸水作为空白对照，标准曲线所得公式为y=6.628 6x+0.301 9，R2=0.991 7。

1.3.3 蛋白提取工艺流程

将杏鲍菇在打浆机中打浆，放入超声破碎机中破碎。经过超声波破碎后，用蜗牛酶进一步水解细胞壁，然后用0.1 mol/L NaOH溶液将浆液pH值调到10.0，浸提1 h，以6 000 r/min速率离心15 min，取上清液用0.1 mol/L HCl溶液调pH值到等电点，静止1 h，沉淀析出后以6 000 r/min速率离心10 min，得到蛋白沉淀进行冷冻干燥，制得的杏鲍菇蛋白粉以备后续实验使用。

1.3.4 蛋白提取率的计算

1.3.5 超声波破碎条件优化设计

根据单因素试验，以蛋白提取率为测定指标，确定超声功率、超声时间和水料比3 个因素对细胞破碎程度的影响。单因素试验基本条件为超声功率300 W、超声时间20 min、水料比3∶5（mL/g），在其他条件不变的情况下改变其中一个单因素，分析其因素对提取率的影响，试验因素和水平见表1。根据单因素试验结果，利用Design-Expert 8.0.6软件，采用中心组合试验设计原理，选择超声功率、超声时间和水料比3 个因素为变量，以蛋白提取率为响应值，设计三因素三水平的响应面分析试验，其因素与水平设计见表2。

表1 单因素试验因素和水平Table1 Factors and levels used in single factor experiments

表2 中心组合试验因素与水平Table2 Independent variables and their coded levels used in response surface analysis

1.3.6 蜗牛酶水解菌体细胞壁条件优化设计

1.3.6.1 单因素试验设计

经过超声破碎后的杏鲍菇浆液，用蜗牛酶进一步溶解细胞壁，以蛋白提取率为指标，确定蜗牛酶水解细胞壁之后的提取效果。单因素试验基本条件定为：酶用量5%、pH 5.0、温度50 ℃、时间1.5 h。在其他条件不变的情况下改变其中一个单因素，分析该因素对杏鲍菇蛋白提取率的影响。各因素梯度为：酶用量：1%、3%、5%、7%、9%；pH值：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；温度：40、45、50、55、60 ℃；时间：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。每组试验重复3 次。

1.3.6.2 细胞壁破碎最佳工艺的优化

根据单因素试验，以蛋白提取率为指标，确定酶用量、pH值、时间和温度4 个因素对细胞破碎程度的影响。根据单因素试验结果，设计四因素三水平L9（34）的正交试验，筛选蜗牛酶破碎细胞壁最佳条件，因素与水平设计见表3。

表3 正交试验因素与水平Table3 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.6.3 神经网络模型的建立

利用Matlab 7.0软件中的神经网络工具箱，拟建立含有三层网络结构的BP网络模型，三层网络的结构分别由输入层、隐含层和输出层构成。在正交试验结果的基础，从正交表中随机选取7 组因素水平组合作为输入样本，蛋白提取率结果作为输出样本，使用BP神经网络专用函数net=newff建立网络模型[17-20]。使用正交试验数据进行对BP网络的训练。在学习和训练过程中，通过调节连接权值和阈值使网络达到预期的误差范围内，并用另外随机两组数据来检验模型的泛化能力。运用建立好的网络模型进行数据仿真，得出蜗牛酶更精确的酶解最佳条件。

2 结果与分析

2.1 等电点的确定

利用考马斯亮蓝法先确定了杏鲍菇蛋白的等电点pI值的大致范围在3～4左右，随后进一步更加精确测得等电点pI值为3.6。

2.2 超声破碎条件对蛋白提取率的影响

2.2.1 单因素试验结果

图1 超声破碎条件超声功率（a）、超声时间（b）、水料比（c）对蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic cell disruption conditions on the extraction yield of protein

由图1a可以看出，蛋白提取率随着超声功率的不断增大而显著升高，这是因为功率变大，空化作用的效果增强，超声波对细胞壁的破碎作用也随之增强[21]，蛋白释放率逐渐增大。但随着功率达到300 W后，蛋白溶出速率未见显著提升，所以在做条件优化试验时宜选用200、300、400 W。由图1b可以看出，蛋白提取率随着超声时

间的延长而缓慢升高，在25～30 min之间破碎效果达到最佳，说明增加破碎时间有助于细胞壁的破碎，原因是超声波所产生的机械效应和空化效应大大加强了细胞破碎程度，显著增大了蛋白溶出速率。经过30 min之后，蛋白提取率反而下降，应该是破碎时间过长，菌体细胞内降解酶溢出，并随着时间的延长，机器产生大量热能使蛋白质降解和变性[22]。因此选用超声时间为20、25、30 min。图1c中，随着加水量的增大，在水料比为2∶5时出现一个波峰。这是由于杏鲍菇浆液质量浓度过高时超声波难以形成空化作用，机械效应大多被转换为了单纯的热量[23]，不利于蛋白质的溶出。如若加水过多，导致浆液本身总蛋白含量下降，造成资料浪费，超声破碎利用不充分，考虑到成本和提取效率，优化试验时宜选用水料比1∶5、2∶5、3∶5。

2.2.2 模型的建立及显著性检验[24-25]

表4 响应面试验设计及结果Table4 Program and experimental results of RSA

三因素二次回归旋转组合设计与结果如表4所示，其中试验号由Design-Expert 8.0.6软件随机产生。对表4中的数据进行二次多元回归拟合，得到蛋白提取率（Y）对A、B、C的二次多项回归方程为：Y=50.92-0.24A+3.94B-1.37C+2.88AB-1.95AC+2.21BC-4.1A2-5.32B2-6.14C2。

从表5可分析出，回归模型显著性检验P＜0.000 1，表明模型预测性良好。失拟项P＞0.05，说明回归拟合充分，可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，模型具有统计学意义。显示出较高的显著性，即93%以上可由工艺条件来解释，不可解释部分不足7%。预测决定系数、变异系数、信噪比均在合理范围内，表明该模型预测性很好，说明该方程的拟合度良好，可以对超声破碎法提取蛋白进行分析和预测。一次项、二次项中除了A项对蛋白提取率的影响不显著，其他因素均有显著影响，交互项中AB对蛋白提取率有极显著作用，其他影响显著。所选取的因素水平范围内，三因素对蛋白提取率影响的显著性依次为：B＞C＞A。

表5 响应面二次回归方程方程模型方差分析结果Table5 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic model

2.2.3 响应面分析与优化

图2 各工艺参数交互作用对超声破碎影响的响应面图Fig.2 Response surface plots showing the effects of process parameters on the efficiency of cell disruption using ultrasonic treatment

由图2a、b可知，在一定范围内，随着功率的增加，杏鲍菇蛋白提取率有一个逐渐增加的阶段，且增幅也同时逐渐增加，当功率达到一定值（约310 W）时，蛋白提取率达到最大值。由图2a、c可知，超声时间对蛋白提取率的影响显著，随时间的延长，蛋白提取率有一个迅速增加的阶段，当超声时间超过一定值（约26 min）时，时间的继续延长会导致提取率的降低。由图2b、c可见，随着加水量的增加，蛋白提取率呈开口向下的抛物线形式，水料比达到一定值（约1.95∶5）时，蛋白提取效果最好。

2.2.4 响应面模型的验证

经回归方程计算得到超声破碎细胞壁提取蛋白的最优工艺参数为超声功率312.26 W、超声时间26.95 min、水料比1.95∶5（mL/g），在此条件下，模型预测的提取率理论值为51.716 2%。考虑到现实操作情况，在实验过程中将制备参数修正为超声功率300 W、超声时间26 min、水料比1.95∶5（mL/g），在该条件下，进行验证实验，得到杏鲍菇的蛋白提取率为48.82%，与模型预测值之间的差值仅占预测值的5.6%，证明模型拟合程度良好，模型的选择合适。

2.3 蜗牛酶水解细胞壁对蛋白提取率的影响

2.3.1 单因素试验结果

图3 蜗牛酶水解因素对蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of snailase hydrolysis conditions on the extraction yield of protein

由图3a可以看出，pH值的变化对酶活性有非常显著的影响。张涛等[10]研究指出蜗牛酶活性最适pH值在4.5左右，当pH值到达5时破壁效果最好，与其研究结果大致相仿。当pH值继续升高，酶活性迅速下降，所以选取pH值范围4.5～5.5作为正交试验水平。图3b显示，温度对蛋白提取率的影响是先上升后下降，随着温度的升高蜗牛酶活性迅速增大，当温度达到40 ℃时，蜗牛酶活性达到最大值，蛋白溶出速率也达到最大，随着温度的继续升高，酶活性遭到破坏，破壁率显著下降，蛋白提取率也随之降低。蜗牛酶的反应温度相对温和，温度的升高加速了酶促反应速率，同时也不断使酶蛋白变性，丧失酶活性。最适温度是两种对抗性的综合效果，所以选取温度范围35～45 ℃作为正交试验水平。由图3c可以看出，蛋白提取率随着酶用量的增加而呈逐渐上升的趋势，当酶用量达到5%时，蛋白提取效果最好。随着酶用量的继续增加，蛋白溶出速率几乎不变，说明酶反应质量浓度已达到饱和状态，再增大酶的用量会造成资源浪费和成本的增大，因此做正交试验时选用酶用量为3%、5%和7%。如图4d所示，刚开始蛋白溶出速率会随酶解时间的延长迅速升高，当酶解反应达到一定时间后，酶解效果逐渐减缓，当反应时间达到1.5 h时，蛋白提取效果达到最佳水平，当酶解时间达到2.5 h后反而出现蛋白提取率下降的结果，可能是蛋白质发生变性。所以宜选用酶解时间1.0、1.5、2.0 h作为正交试验水平。

2.3.2 正交试验分析和BP神经网络的建立

在单因素试验的基础上，确定了四因素三水平L9（34）筛选蜗牛酶破碎细胞壁最佳条件，其试验结果和方差分析见表6、7。根据表6随机划分7组数据为训练集和2组数据为测试集，利用训练集检验网络泛化能力。

表6 正交试验设计与结果Table6 Orthogonal array design with experimental results for enzymatic hydrolysis

表7 方差分析Table7 Analysis of variance for enzymatic hydrolysis

因为酶解时间对试验的影响最不显著，所以在分析的过程中可以将其设置为误差项进行方差分析。校正模型用来判断模型中系数有无统计学意义，由表7可以看出，模型P＜0.05，则所用的模型有统计学意义。酶解的温度P＜0.01，说明对蛋白提取率的影响极显著，而pH值和酶用量的P值都小于0.05，说明对蛋白提取率均有较大影响。根据上述试验结果得出最优组合即温度40 ℃、pH 5.0、酶用量7%、时间1.5 h，在此条件下的蛋白提取率为72.82%，但不一定反映了全局最佳提取条件，有可能在温度40 ℃和pH 5.0左右会有更好的提取条件，因此，利用了人工神经网络模型的仿真模拟去寻找更精确的酶解条件。

图4 7 组训练集的BP神经网络误差曲线Fig.4 Error curve of BP neural network for seven groups of training set

由图4可以看出，利用7组训练数据[26]，确定输入层神经元个数为3，输出层神经元数目为1，学习率net.trainParam.lr取0.01，动量因子net.trainParam.mc取0.02，迭代次数net.trainParam.epochs取50，误差目标net. trainParam.goal取0.001，隐含层神经元数确定为3～12，主要是改变神经网络中隐含层神经元数目来确定误差最小，当确定神经元数目为9时拟合效果较好，迭代次数达到29时，训练达到了误差范围之内。

2.3.3 BP网络神经仿真数据的检验

确定酶用量和酶解时间分别为7%和1.5 h，将pH值固定为5.0，运用建立好的神经网络模型在酶解温度40℃附近进行数据仿真，结果见图5a。图5a中，42.8 ℃为最佳温度；仍旧在确定的酶用量和时间条件下，固定酶解温度为42.8℃，应用神经网络模型在pH 5.0附近进行数据仿真，结果见图5b。从图5b得出，pH 4.8时蛋白的释放效果最好。至此，得出最佳酶解条件为：酶用量7%、酶解时间1.5 h、酶解温度42.8 ℃、pH 4.8。通过模型仿真得出蛋白提取率为76.43%，最佳酶解条件下的验证实验提取率为75.92%。

图5 因素对提取效果影响的仿真结果Fig.5 Simulation results of the effects of hydrolysis temperature (a) and pH (b) on the extraction efficiency

2.4 超声破碎辅助酶解提取蛋白效果验证实验

为了直观验证超声辅助蜗牛酶提取杏鲍菇子实体蛋白的效果，采用热水浴碱提法提取杏鲍菇蛋白，随之进行提取结果的比较。实验重复6 次，结果见表8，取平均值得到提取率仅为42.57%。经过超声辅助蜗牛酶处理的杏鲍菇浆液，其蛋白提取率高达75.92%，相较提高了33.35%。同时，超声破碎辅助酶解提取时间缩短了约30 min，碱液浓度也有所下降，节省了碱的用量，说明超声辅助蜗牛酶水解是一种行之有效的提取方法。

表8 超声辅助酶解提取与热水浴碱提比较Table8 Comparison of ultrasound-assisted enzymatic extraction and hot alkali extraction

3 结 论

利用响应面法得出了最佳提取条件为超声功率300 W、超声时间26 min、水料比1.95∶5（mL/g）。使用蜗牛酶水解细胞壁，经过正交试验得出最佳酶解条件为温度40 ℃、pH 5.0、酶用量7%、时间1.5 h，此条件下杏鲍菇子实体蛋白提取率达到了72.82%；运用BP神经网络模型在正交试验的基础上仿真计算出更精确的酶解条件为温度42.8 ℃、pH 4.8、酶用量7%、时间1.5 h，其提取率为76.43%，经过验证实验得到真实提取率为75.92%，相比正交试验结果提高了4%。寻找到了因素水平内的全局最佳组合，为杏鲍菇蛋白提取找到了理想的酶解条件。经与直接碱提法工艺比较，超声波辅助蜗牛酶水解工艺，其提取率明显高于直接碱提法，且省时、省料，证明该方法合理、可行，对相关企业开展杏鲍菇子实体蛋白提取生产具有一定的参考价值。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Snailase Hydrolysis for Extraction of Protein from Pleurotus eryngii

QI Qianya, YUN Jianmin*, HUANG Yuqin, BAI Jie, ZHANG Wenwei, AI Duiyuan
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The aim of this work was to enhance the efficiency of protein extraction from fruit bodies of Pleurotus eryngii by cell disruption using ultrasonic irradiation followed by snailase hydrolysis. Response surface methodology, orthogonal array design and artificial neural network model were used in combination to optimize the conditions for ultrasonic irradiation and subsequent enzymatic hydrolysis, respectively. The protein extraction efficiencies of the presented method and the hot alkali method were compared. The best efficiency of cell disruption was achieved upon ultrasonic treatment for 26 min at 300 W power with a solid-to-water ratio of 1.95:5 (mL/g), which resulted in a protein yield of 48.82%. The optimum hydrolysis conditions that provided maximum protein yield of 75.92% were determined as 42.8 ℃, 4.8, 7% and 1.5 h for temperature, pH, enzyme dosage and hydrolysis time, respectively, which was increased by 33.35% compared with hot alkali extraction. These results showed that ultrasonic-assisted snailase hydrolysis could significantly increase the efficiency of protein extraction from P. eryngii fruit bodies.

Pleurotus eryngii; protein; ultrasonic-assisted extraction; snailase; artificial neural network

10.7506/spkx1002-6630-201622012

TS255.2

A

1002-6630（2016）22-0085-07

漆倩涯, 贠建民, 黄玉琴, 等. 超声破碎辅助蜗牛酶提取杏鲍菇蛋白工艺优化[J]. 食品科学, 2016, 37(22): 85-91. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622012. http://www.spkx.net.cn

QI Qianya, YUN Jianmin, HUANG Yuqin, et al. Optimization of ultrasonic-assisted snailase hydrolysis for extraction of protein from Pleurotus eryngii[J]. Food Science, 2016, 37(22): 85-91. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201622012. http://www.spkx.net.cn

2014-04-13

甘肃省农业生物技术专项（GNSW-2011-18）；甘肃农业大学青年导师基金项目（GAU-QNDS-201205）

漆倩涯（1990—），女，硕士研究生，研究方向为营养与食品卫生。E-mail：18394662384@163.com

*通信作者：贠建民（1968—），男，教授，博士，研究方向为微生物与发酵工程。E-mail：yunjianmin@gsau.edu.cn