天然保鲜剂复配工艺优化及其对水晶肴肉中特定腐败菌的抑制效果

2016-12-06姚永杰徐宝才王周平

食品科学 2016年22期

姚永杰，徐宝才*，王周平，李聪

（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122；2.肉品加工与质量控制国家重点实验室，江苏南京 211806；3.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏南京 210095；4.江苏雨润肉类产业集团有限公司，江苏南京 211806）

姚永杰1,2，徐宝才2,3,4,*，王周平1，李聪2,4

通过二倍稀释法测定ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）、乳酸链球菌素（Nisin）、肉桂醛、茶多酚（tea polyphenols，TP）、甘氨酸（glycine，Gly）以及复配单、双硬脂酸甘油酯（mono-and diglycerides monostearate，GMS）对水晶肴肉特定腐败菌的抑菌效果，其对嗜冷杆菌属、肠球菌属等的最低抑菌浓度分别为19.53、156.25、156.25、312.5、625、5 000 mg/kg。通过棋盘稀释法测定两两之间的协同效应指数，明确了ε-PL、Nisin、TP、肉桂醛具有协同效应。通过正交试验对其进行复配，得出最优配方为ε-PL 39 mg/kg、Nisin 468 mg/kg、TP 312.5 mg/kg、肉桂醛234.25 mg/kg。将研究结果应用于肴肉，在保质期内可明显控制细菌总数和大肠菌群的增长，尤以7 d和15 d最为显著，细菌总数抑制率分别达到86%、74%。

水晶肴肉；ε-PL；肉桂醛；Nisin；茶多酚

水晶肴肉亦叫水晶肴蹄，是镇江传统肉制品，以皮色洁白、卤冻透明、光洁晶莹、瘦肉鲜红、香味浓郁、风味独特而驰名，与镇江的香醋、锅盖面并称为“镇江三怪”[1]。目前工业化水晶肴肉是在中式传统工艺基础上，引进现代低温肉制品加工技术，但由于水晶肴肉煮制后工序工艺繁琐，且多为人工操作[2]，容易引起微生物滋生，发生二次污染，导致产品腐败变质[3-5]。即便产品在0～8 ℃条件下运输、保存和销售，仍有嗜冷菌繁殖导致产品卫生指标或产品质量指标不合格。延长水晶肴肉货架期的可行办法有添加抑菌剂[6-7]、控制过程卫生[8]以及巴氏杀菌，而单独控制过程卫生，二次污染并不能得到有效解决；巴氏杀菌虽是解决产品二次污染的有效途径，但水晶肴肉中的卤冻主要是由精腱肉和猪皮熬制的汤冷冻而成，融点只有23 ℃左右，杀菌严重影响产品口感及外观[9]。

肴肉菌谱范围宽，细菌品种繁多（如乳杆菌属、肉食杆菌属、耶尔森菌属和沙雷氏菌属、索丝菌属等，其中既有革兰氏阳性菌，也有革兰氏阴性菌），仅仅添加一种或二种单体防腐剂，较难达到理想防腐效果[3,6]，为有效延长肴肉货架期，有必要同时使用多种天然绿色防腐抑菌剂以实现联合抑菌。

本研究针对肴肉特定腐败菌（中间耶尔森菌、屎肠球菌和清酒乳杆菌）[6]，选用了ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）、乳酸链球菌素（Nisin）、肉桂醛、茶多酚（tea polyphenols，TP）、甘氨酸（glycine，Gly）以及复配单、双硬脂酸甘油酯（mono-and diglycerides monostearate，GMS）（主要包括月桂酸单甘酯等）等具有环境友好、生物活性多样等优势的天然防腐剂，以最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）和部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentrations index，FICI）为指标筛选出抑菌效果较好的4 种绿色抑菌剂，并采用正交试验的方法对种抑菌剂进行复配，并应用于水晶肴肉中，观察抑菌效果，从而为控制肴肉微生物增长这一行业难题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、材料与试剂

前期对腐败肴肉菌相进行高通量测序得其腐败菌，主要为厚壁菌门（31.3%），其中比较多的是以下几个属：巨球菌属、变形杆菌属、嗜冷杆菌、盐水球菌属、葡萄球菌、肉食杆菌属、漫游球菌属、明串珠菌属、肠球菌、摩根氏菌属，其中只有摩根氏菌属、变形杆菌属为革兰氏阴性，其余均为革兰氏阳性菌。测序工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。为更加接近肴肉实际菌相，实验以实际分离到的混合菌为受试菌。

ε-PL 浙江工业大学实验室；GMS 杭州康源食品科技有限公司；Nisin 山东福瑞达生物科技有限公司；TP 烟台强诺商贸有限公司；Gly 河南盛之德商贸有限公司；肉桂醛上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、PCA培养基、营养肉汤及其他实验所需试剂均由江苏雨润国家重点实验室提供；猪皮、精腱肉、卤汤及香辛料均由江苏雨润肉类产业集团肴肉生产车间提供。

1.2 仪器与设备

磁珠菌种保存管青岛海博生物科技有限公司；96 孔酶标板泰州为尔康医用品有限公司；超净工作台扬州净化设备有限公司；GRP-9080隔水式恒温培养箱上海森信实验仪器有限公司；1 mL、200 μL移液枪德国Eppendorf公司；MJ-7BA高压蒸汽灭菌锅施都凯仪器设备（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备[10-11]

真空包装水晶肴肉冷藏40 d后，表面已长大量菌斑，出水、发黏、有气泡、恶臭。配成10%的菌悬液后，于脑心浸出液肉汤36 ℃增菌24 h，并用磁珠冻存管保存。每次实验前，取一磁珠至营养肉汤（nutrientbroth，NB），36 ℃条件下复壮后配制成菌数量浓度为105～106CFU/mL的菌悬液，备用。

1.3.2 保鲜剂溶液配制

用无菌蒸馏水溶解ε-PL、Nisin、TP、GMS配制成1%的溶液；Gly配成10%的溶液；肉桂醛用20%乙醇溶液[12]配制成1%的溶液。

1.3.3 MIC的测定[13-14]

采用二倍稀释法测定MIC：取无菌96 孔平底板，从第1～12列依次加入100 μL NB，第1列再加入100 μL蒸馏水，第12列再加100 μL培养液分别作阴性和阳性对照，第2列加入1%的防腐剂100 μL，混匀后吸取100 μL至第3列中，依此类推进行倍比稀释至第11列，混匀后弃掉100 μL，使稀释后各孔中的受试药物浓度倍比减少，最后于2～12号孔中各加入菌悬液100 μL，培养。评判标准为：有抑菌作用：菌液清澈透明；无抑菌作用：菌液混浊、有沉淀或絮状悬浮物或在液面下或孔壁上形成菌膜[15]。将有抑菌作用最低含量记为MIC。实验设置2个平行，每次实验进行2 次验证。

1.3.4 FICI的测定

根据单一防腐剂MIC测定结果，按棋盘稀释法[16]略作修改进行测定。取无菌96 孔板在第1列加入100 μL水和100 μL NB作阴性对照，第2～8列依次加入

8～1/16 MIC的防腐剂a，以同样方法在第A～F行依次加入8～1/16 MIC的防腐剂b，然后加入100 μL菌悬液，混匀于36 ℃培养24～36 h，观察结果。按下式计算FICI判定防腐剂复配效果：

FICI＝FICa+FICb＝MIC（a/a+b）/MICa+MIC（b/a+b）/MICb

式中：FIC为部分抑制浓度；MIC（a/a+b）、MIC（b/a+b）为当a与b的复合物对某种微生物达到完全抑制时，复合物中a或b的抑制浓度；MICa、MICb为防腐剂a或b对该菌的最低抑制浓度。

FICI＜0.5，协同作用；FICI＝0.5～1，部分协同或相加作用；FICI＝1～2，无关作用；FICI＞2，拮抗作用。设置2 个平行，每次实验进行2 次验证。

1.3.5 复配保鲜剂对供试菌抑制效果测定

4 种保鲜剂的复配：根据1.3.3节和1.3.4节确定的4 种保鲜剂进行复配，以TP、Nisin、ε-PL和肉桂醛为单因素，每个因素设置3 个水平（其中肉桂醛具有浓郁肉桂味，根据前期实验，用量达到312 mg/kg时会影响肴肉风味，而234 mg/kg不至于降低风味），做四因素三水平的正交试验，以抑菌率为指标，确定4 种天然抑菌剂的最佳用量，正交试验因素与水平设计如表1所示。

表1 正交试验因素与水平Table1 Levels of the factors used in the orthogonal array design

复配抑菌剂离体抑菌效果的测定：于9 mL NB中加入200 μL已稀释的菌悬液，0号管加800 μL蒸馏水作对照组，其余试管依次按配方终用量加入相应体积的防腐剂溶液，置于36 ℃恒温箱中培养24 h，然后用平板稀释法测定各管中活菌浓度，计算抑菌率。每次试验平行3 次。

1.3.6 保鲜剂产品应用效果评价

将1.3.5节中筛选出的较优搭配应用于产品，参照GB 4789.2—2010《菌落总数测定》和GB 4789.3—2010《大肠菌群计数》测定产品0、7、15、22、30 d的细菌总数和大肠菌群。水晶肴肉加工工艺及保鲜剂添加方法如下：

保鲜剂用无菌纯水分别配成10 g/100 mL的溶液后，按配比称好与卤汤混匀，倒入模具，装模成型。

2 结果与分析

2.1 MIC测定结果

表2 6 种抑菌剂对受试菌的MICTable2 MICs of six food preservatives against the tested bacteria

由表2可知，MIC测试结果表明几种抑菌剂对肴肉杂菌的抑菌作用由强到弱依次为：ε-PL＞肉桂醛= Nisin＞TP＞Gly＞GMS。GMS的MIC达到5 000 mg/kg，大于GB 2760—2014限量，并未表现出明显的抑菌效果，可能与GMS中发挥主要抑菌作用的月桂酸单甘酯（GML，具有乳化和抑菌双重功能，抑菌谱广[17]）比例较低有关，且实验中所用指示菌为肴肉腐败菌，主要为革兰氏阴性[6]，而GML对革兰氏阴性菌的抑制效果弱于革兰氏阳性菌且培养温度不利于GML最好的发挥作用。Gly的MIC为625 mg/kg，超过GB 2760—2014限量，同时也没有表现出明显的抑菌效果，可能与抑菌剂及受试菌本身的特性有关。ε-PL对指示菌有明显的抑菌效果，这与其广谱抗菌性有很大关系。据文献报道，在中性及偏酸环境中ε-PL对肠膜明串珠菌[18-20]、金黄色葡萄球菌的MIC分别为50、12 mg/kg，ε-PL对革兰氏阴性菌中，大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、空肠弯曲菌及铜绿假单胞菌的MIC为50、16、100、3 mg/kg。另外，ε-PL具有使用成本低、抗菌谱广（包括耐热性芽孢杆菌在内的细菌）、耐高温（120 ℃，20min）、pH值使用范围广（pH 2～9）、协同增效性强[21]、安全性高等特点，可在肴肉煮制过程中单独加入，以防止煮制后等待后续工艺过程中微生物的增长。因此，ε-PL有可能在后期防腐剂复配实验及抑制产品中腐败菌生长方面发挥主要作用。Nisin、肉桂醛的MIC均为156.25 mg/kg，这与其他文献所记录数据基本一致[22-25]。肉桂醛抑菌效果较好，但由于其本身特有的浓重桂皮味道，且肴肉配方中本身也含有肉桂，高用量的肉桂醛则会影响产品的风味。TP的MIC所测结果为312.5 mg/kg，TP在低用量的时候可以诱导群体感应信号分子产生，达到一定质量浓度才对混合菌起抑制作用[26-28]。

2.2 FICI测定结果

不同抑菌剂作用机理不同，每种抑菌剂也可能不止一种作用机制，而且目前有些机理尚不明确，以下列出本实验所选保鲜剂几种可能的抑菌机理。Nisin： 1）吸附于敏感细菌细胞膜，在其表面形成孔径，导致细胞内容物泄露，失去质子动力，细胞裂解；2）Nisin中的二十二碳六烯酸和2,5-二羟基苯甲酸能够与某些酶的巯基发生作用，抑制细胞壁中肽聚糖的生物合成，阻断细

胞膜和磷脂化合物的合成，从而导致细胞内物质外泄；3）在芽孢萌发前期及膨胀期通过破坏它的膜抑制其发芽过程[29]。TP：1）影响细菌膜上的酶，破坏膜结构，使细胞膜微脂粒凝集；2）特异性地沉淀细菌蛋白；3）与细胞遗传物质结合，影响转录和复制[26-28]。Gly：1）具有较强的配位能力和多样化的配位模式，其分子中活泼的氨基，易于进行化学修饰和结构改造，可增加特殊结构的配位位点，其衍生物具有较强抑菌作用[30]；2）富含甘氨酸的抗菌肽具有抗菌作用，如肉蝇毒素C端结构域富含甘氨酸，通过抑制细菌细胞壁的形成，致使细菌死亡；天蚕葛佬素的甘氨酸含量为18%，通过抑制细菌细胞最外层细胞膜蛋白的合成，导致细胞膜通透性增加；3）与ε-PL、Nisin复配应用于冷鲜猪肉、酸奶、炸鸡等食品中，具有协同增效作用，能够增加对革兰氏阳性菌的抑制效果。ε-PL：1）与带阴离子的物质作用产生较强的静电作用，且对生物膜穿透力强；2）作用于生物膜系统和蛋白合成系统，与核糖体结合，从而抑制蛋白和酶生物大分子的合成；3）破坏膜结构完整性，使细胞的选择性改变，ATP和还原物质NADH亏缺，中断细胞的物质、能量和信息传递，呼吸作用受到影响，细菌能量代谢和物质代谢破坏，导致胞内溶酶体膜破裂而诱导微生物产生自溶作用。肉桂醛：1）阻碍鞭毛蛋白和细胞膜的正常合成和代谢，对菌体形态产生影；2）影响菌体正常的蛋白合成和聚集；3）抑制ATP酶，影响细菌的正常代谢；4）吸附于菌体表面，破坏细胞壁多糖结构[22-24]。GMS：1）破坏细胞膜上的电子传递系统和氧化磷酸化以及引起细胞壁外膜LPS外泄[31-34]；2）GML为油相的食品级微乳液作用于细菌细胞膜，使得细胞表面疏水性下降、细胞膜通透性的增加，从而导致细菌迅速死亡。

表3 两种保鲜剂单用和联用作用效果Table3 Effects of two preservatives alone and in combination against the tested bacteria

如表3所示，单一抑菌效果较差的GMS与Nisin为协同作用，但与抑菌效果最好的ε-PL为拮抗作用，因此GMS不宜用于后续复配实验。Gly与ε-PL、Nisin均为拮抗作用，会阻碍二者抑菌作用的发挥，复配中也不宜采用。TP与ε-PL、Nisin均为协同作用，可扩大抗菌谱。肉桂醛与本实验所选几种防腐剂中抑菌效果最好的ε-PL为协同作用，与Nisin、TP的FICI均为1.03，表现为无关作用，不会阻碍二者抑菌作用的发挥。两种抑菌剂的协同或拮抗作用取决于二者作用机理，现在已知的4 种协同抗菌机制包括：抑制一系列生化途径致细菌死亡；抑制保护性细菌酶的活性；增强对细菌细胞壁的联合作用；增强其他抗菌物质的摄取等[35]。

2.3 复配保鲜剂对供试菌抑制配方优化结果

表4 保鲜剂配方优选正交试验设计与结果Table4 Orthogonal array design with experimental results

如表4所示，3、6号试验即A1B3C3D3、A2B3C1D1相对于对照组抑菌率分别达到了99%、100%，效果显著。通过对菌落数进行极差分析可得，各因素间的主次顺序为肉桂醛用量、Nisin用量、TP用量、ε-PL用量。最优水平组合为A2B3C1D3，即312.5 mg/kg TP、468 mg/kg Nisin、39 mg/kg ε-PL、234.25 mg/kg肉桂醛。

表5 最优配方验证结果Table5 Verification of the optimal formulation

对最优水平组合进行验证，结果如表5所示，其菌落数明显低于对照，抑菌率达到100%。

2.4 保鲜剂产品应用效果评定

由图1可以看出，30 d贮藏期内，随贮藏时间延长处理组和对照组的菌落总数和大肠菌群数均呈逐渐上升趋势，且处理组上升速率低于对照组。0d时处理组和对照组无显著差异，7 d时处理组显著低于对照组，细菌总数及大肠菌群抑制率最高，分别达到86%、97%；7 d后微生物迅速增长，到15 d处理组抑制率稍有降低，分别为

74%、73%；22d与15d贮藏点的菌落总数无明显差异，产品菌相达到相对稳定状态；之后，大肠菌群又出现一个迅速增长期，细菌总数也略有增长，到30 d时保鲜剂抑制效果减弱，处理组中细菌总数及大肠菌群抑制率分别为10%、27%。在30 d贮藏期内，处理组可有效抑制细菌总数及大肠菌群的增长速率，微生物的繁殖得到了有效的控制，有望将产品保质期延长到40 d以上。

图1 细菌总数（A）和大肠菌群数（B）变化趋势Fig.1 Changes in total bacterial count (A) and coliform bacterial count (B) during storage of Yao meat

另外，TP、ε-PL、肉桂醛不仅可通过表3中所述机理发挥抑菌效果，还具有其他方面的作用。如Nisin可以抑制芽孢生长，从而在抑制肴肉中未杀灭的芽孢萌发，发挥主要作用[3]。TP还可以通过其抗氧化作用稳定肉色，提高鸵鸟肉[36]、猪肘[37]、腌肉[38]等的发色率，可减少肴肉生产中亚硝酸盐的使用，从而较大幅度的降低亚硝酸钠残留量[38]；降低脂肪氧化速率；减缓蛋白质变性和降解速率[25,39]。肉桂醛是通过破坏菌体细胞壁多糖结构达到抑菌效果的，而哺乳动物没有细胞壁，因而不会对人类和动物的细胞产生损害作用[24]，且肉桂醛的肉桂味可增加肴肉风味。ε-PL还可以作为营养强化剂增加肴肉赖氨酸含量。因此此生物保鲜剂配方用于水晶肴肉可安全、高效的发挥抑菌作用。

3 结论

本研究结果表明6 种供试防腐剂对水晶肴肉腐败微生物的抑菌效果强弱顺序为：ε-PL＞肉桂醛=Nisin＞TP＞Gly＞GMS。FICI表明ε-PL、Nisin、TP两两协同，肉桂醛与ε-PL也为协同作用，与Nisin、TP均为无关作用。对ε-PL、Nisin、TP和肉桂醛4 种抑菌剂进行正交复配，得出抑菌液最优水平组合312.5 mg/kg TP、468 mg/kg Nisin、39 mg/kg ε-PL、234.25 mg/kg肉桂醛的离体实验抑菌率达到99%以上，应用于产品后，7 d时细菌总数及大肠菌群抑制率最高，分别达到86%、97%；15 d时抑制率稍有降低，分别为74%、73%。由此可得筛选出的复配生物保鲜剂可有效控制肴肉微生物增长。

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Optimization of Blends of Natural Preservatives for Improved Antimicrobial Effect against Specific Spoilage Organisms in Yao Meat

YAO Yongjie1,2, XU Baocai2,3,4,*, WANG Zhouping1, LI Cong2,4
(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. State Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Nanjing 211806, China; 3. Collaborative Innovation Center of Meat Processing and Quality Control, Nanjing 210095, China; 4. Jiangsu Yurun Meat Product Group, Nanjing 211806, China)

The antibacterial effects of ε-poly-L-lysine (ε-PL), cinnamic aldehyde, nisin, tea polyphenols (TP), glycine (Gly), and mono-and diglycerides monostearate (GMS) added individually and in combination against special spoilage organisms in Yao meat were tested by the two-fold dilution method. The minimal inhibitory concentrations (MIC) of nisin, GMS, ε-PL, Gly, TP, cinnamic aldehyde against mixed cultures of bacteria isolated from spoiled Yao meat including Psychrobacter and Enterococcus were determined as 156.25, 5 000, 19.53, 625, 312.5, and 156.25 mg/kg, respectively. Based on the synergism index for two of these preservatives determined by the checkerboard dilution method, it was confirmed that ε-PL, nisin, TPs and cinnamic aldehyde had synergistic effects. Using an orthogonal array design, the optimum combination of these selected preservatives was determined as ε-PL 39 mg/kg, nisin 468 mg/kg, TPs 312.5 mg/kg and cinnamic aldehyde 234.25 mg/kg. When the formulation was applied in Yao meat, the growth of total and coliform bacteria could be significantly controlled during the shelf life, especially on the 7thand 15thday, with percentage inhibition of total bacteria of 86% and 74%, respectvely.

Yao meat; ε-poly-L-lysine (ε-PL); cinnamic aldehyde; nisin; tea polyphenols (TP)

10.7506/spkx1002-6630-201622001

TS251.6

1002-6630（2016）22-0001-06

姚永杰, 徐宝才, 王周平, 等. 天然保鲜剂复配工艺优化及其对水晶肴肉中特定腐败菌的抑制效果[J]. 食品科学, 2016, 37(22): 1-6. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622001. http://www.spkx.net.cn

YAO Yongjie, XU Baocai, WANG Zhouping, et al. Optimization of blends of natural preservatives for improved antimicrobial effect against special spoilage organisms in Yao meat[J]. Food Science, 2016, 37(22): 1-6. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622001. http://www.spkx.net.cn

2016-04-21

国家自然科学基金面上项目（31571909）

姚永杰（1994—），女，硕士研究生，研究方向为肉品科学和产品研发。E-mail：yongjie1015@163.com

*通信作者：徐宝才（1973—），男，研究员，博士，研究方向为肉品科学和产品研发。E-mail：baocaixu@163.com