长链非编码RNA作为肿瘤标志物的研究

范晓航，秦 鑫，张 敏，张文静，廖晓锋，龚文容*

(1.湖北文理学院 医学院，湖北 襄阳 441053；2.华中科技大学同济医学院 病理生理教研室，湖北 武汉 430030；3.湖北文理学院附属医院 普外科，湖北 襄阳 441020)

长链非编码RNA作为肿瘤标志物的研究

范晓航1,2，秦 鑫1，张 敏1，张文静1，廖晓锋3*，龚文容1*

(1.湖北文理学院 医学院，湖北 襄阳 441053；2.华中科技大学同济医学院 病理生理教研室，湖北 武汉 430030；3.湖北文理学院附属医院 普外科，湖北 襄阳 441020)

基因组转录后的产物绝大部分为非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA），编码蛋白质的信使RNA（messenger RNA,mRNA）只占少数.长链非编码RNA（Large non-coding RNA lncRNA）指ncRNA的长度超过200个核苷酸，lncRNA的表达具有高度组织特异性.迄今为止，有超过111000的lncRNAs得到鉴定并发现在组织中呈现出特异性的表达.lncRNAs参与各种细胞过程，包括细胞生长相关的基因表达、分化、DNA复制、重组、修复以及细胞迁移等.文章总结并重点讨论lncRNA表达与肿瘤的关系，尤其是一些在细胞不同分化阶段有差异表达的lncRNA，发现lncRNAs的表达与细胞分化阶段和癌症细胞类型相关.因此，明确已知的lncRNAs，特别是与肿瘤类型、细胞分化、转移相关的lncRNAs的表达谱，对肿瘤的分期、诊断及预后的判断非常有用.在血液或其他组织液选择性的lncRNAs检测将为癌症的早期诊断和大规模的肿瘤筛查提供帮助.

长链非编码RNA；肿瘤标志物；肿瘤筛查

遗传中心法则认为，RNA分子在遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中只起中间载体或分子骨架作用，传统上RNA分子分为信使RNA(mRNA)，核糖体RNA(rRNA)，转移RNA(tRNA)，核仁小分子RNA(snoRNA)和小核RNA(snRNA)等各种类型.然而近年来基因组测序、RNA测序技术及表观遗传学研究中的越来越多证据表明，发育过程中调节生物体复杂性的主要因素是基因组的非编码蛋白质序列[1].在人类基因组中，几乎每一个染色体上的基因都会在至少一个特定的细胞类型的某个阶段被转录.但是这些转录的基因中只有大约5%到10%的基因稳定转录为mRNA和其它各种非编码RNA(ncRNA)[2].这些稳定转录的序列中1%为可以翻译成蛋白质的mRNA，剩下4%～9%则为一些ncRNA，比如小干扰RNA(siRNA)，微小RNA(miRNA)，或Piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)，这些序列高度保守，通过碱基配对与目标基因作用，参与转录和转录后的基因沉默.lncRNAs是ncRNA分子量较大的一种类型，其核苷酸一般大于200 bp，长的可以达到几千个bp.这些lncRNAs的一个主要功能是调节蛋白质编码基因的表达.基因表达调控可发生在不同水平.例如paupar，一种在脊椎动物的中枢神经系统表达的lncRNA，其DNA序列位于编码转录因子Pax6基因的上游.在转录体表达后，可以以顺式作用方式局部调节Pax6基因表达，同时也可以反式作用方式影响其它多个染色体基因的转录[3].lncRNA其它功能还有染色质重塑，调控蛋白质的稳定性、细胞内蛋白质的定位以及蛋白活性等.

lncRNAs可以大小不一，7SK lncRNA仅有340个核苷酸[4]，而AIRN lncRNA超过100 kb[5].lncRNAs可以被RNA聚合酶II或III转录[6]，它们可以是拼接的或不拼接的，可以被定位在细胞质，也可以定位在细胞核[7]. lncRNAs的序列不太保守，在不同细胞过程中的作用机制尚未完全了解.总的来说，与蛋白质编码基因相比，lncRNA通常表达水平较低，但呈现出更强的组织特异性.迄今为止，有超过111000的人类lncRNA已被鉴定，而且数量还在进一步增加.值得注意的是，在高等生物体的基因组中lncRNA数量较高，这间接表明在多细胞生物的进化过程中基于RNA水平控制的重要性[8].

1 lncRNA在肿瘤中的异常表达

lncRNAs在调控细胞增殖中可以抑制或促进细胞生长，lncRNAs也因此可以分别作为原癌基因或肿瘤抑制基因发挥作用.许多lncRNA没有明显的组织特异性，可以在多种不同类型的肿瘤组织表达失调，比如位于12号染色体的Hotair.Hotair可导致多梳抑制复合物2重新分布，染色体结构变化和表观遗传学改变，引起一些基因，尤其是一些肿瘤抑制基因表达减少，多种肿瘤都高表达Hotair，包括肝细胞肝癌,乳腺癌，结直肠癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，食道癌，肺癌，卵巢癌等[9].LncRNA H19位于染色体11p15.5，也在多种肿瘤特别是在转移的癌组织有高表达，在上皮细胞向间质细胞转化的过程中起重要作用[10].lncRNA PCAT-1在侵袭性前列腺癌、膀胱癌、食道癌组织中高表达，可以促进癌细胞的增殖[11].LSINCT5 lncRNA在乳腺癌和卵巢癌细胞细胞系和肿瘤组织中高表达[12].以上这些lncRNA都显示致癌活性，与此相反，GAS5抑制乳腺癌细胞生长，表现出肿瘤抑制活性.用lncRNA GAS5的表达质粒转染细胞可导致转染细胞的死亡，并且细胞死亡的速率与细胞内的GAS5水平呈正相关[13].

此外，lncRNAs还与转移相关.最新的证据显示TGF-β激活的lncRNA(lncRNA-ATB)与曲妥单抗的耐药有关，可以通过多种机制促进肿瘤细胞侵袭转移的过程[14].

一些lncRNA的表达在某些器官以及从这种器官来源的肿瘤细胞表现出较高的组织特异性 (见表1). PCAT-18和PCA3在前列腺癌中特异性高表达，PTCSC3和AK023948在甲状腺组织特异性表达，在癌组织通常表达下调.lncRNA甲状腺乳头状癌易感性候选基因3(PTCSC3)在甲状腺乳头状癌细胞系(TPC-1和bcpap）的高表达可抑制细胞生长和影响参与DNA复制、重组和修复、细胞运动、细胞死亡、肿瘤形态的基因表达.这些研究结果表明，PTCSC3具有抑癌特性，是一种肿瘤抑制基因[15].PTCSC3的表达有严格的甲状腺特异性. lncUSMycN，anti-NOS2A和NDM29是在中枢神经系统特异表达的lncRNA，在神经母细胞瘤组织中表达上调.而NBAT1对神经母细胞瘤细胞的增生和浸润有抑制作用，促进神经元细胞的分化，在神经母细胞瘤时表达降低.CAHM与DNA甲基化相关在结直肠癌出现低表达.lncRNA HEIH在肝细胞肝癌高表达，HEIH通过与EZH2基因的增强子结合抑制EZH2的靶基因，包括p15，p16，p21和p57[16-22].

表1 在癌症中表达的具有高组织特异性lncRNA

2 lncRNA在血液和其他体液中的检测

由于lncRNAs在人类癌症中经常异常表达.因此，这些异常表达的lncRNAs未来有可能作为肿瘤标志物用于癌症的筛查或诊断.随着越来越多的lncRNA的鉴定以及其表达和功能的分析，预期在将来会有更多更特异的lncRNAs作为肿瘤标志物出现.

lncRNAs表达的失调可以在癌细胞或组织中检测，包括新鲜切除的癌组织或活检的标本.然而，这些

方法是浸入性的，有一定的损害和并发症的发生，比如出血或癌细胞的针道转移等.因此，血液检测或使用其他体液，比如在尿液中检测lncRNAs的存在，对癌症的筛查或诊断将有很大的实用价值.以前认为，RNA非常不稳定，迅速降解，最近的数据表明，lncRNA水平可在细胞外检测到，而且相当稳定，因此适合作为生物标志物[23].

Aguilo等人发现H19 lncRNA在胃癌患者的血浆中显著高于健康对照组.此外手术切除肿瘤后血浆H19水平明显低于术前的样品.这表明，血浆中H19水平可作为诊断胃癌的潜在生物标志物[24].Dong等的研究进一步支持检测血液中lncRNAs想法：他们发现胃癌患者的血清中可以检测到CUDR、lsinct-5与PTENP1这三种lncRNA，并可以用来判断预后[25].

尿路上皮癌相关1(UCA1)是一种在膀胱等上皮细胞表达的lncRNA.在膀胱癌患者，尿液中UCA1的含量明显高于健康对照组.UCA1表达的差异也与肿瘤分期、分级显著相关.尽管UCA1在许多肿瘤可能高表达，包括食道癌、结直肠癌、前列腺癌、急性髓性白血病、肾癌等，通过与细胞学诊断方法的敏感度和特异性相比较，可以得出结论：尿液细胞UCA1 lncRNA的检测是适合用于膀胱移行细胞癌(TCC)诊断的生物标志物，尤其是在癌症早期对细胞学诊断起辅助作用[17].

PCA3是迄今为止发现的最为特异的表达于前列腺癌(PCa)的lncRNA，常在临床上用于对前列腺针刺活检标本或体液,如血液、精液、尿液、前列腺按摩液进行分析[26].PCA3是肿瘤抑制基因PRUNE2的反义基因，通过形成PRUNE2/PCA3双链RNA并通过腺苷脱氨酶作用于RNA依赖的腺苷向肌苷转变的RNA编辑来控制PRUNE2的表达及活性[21].Gen-Probe,Inc公司在2012年发明了一种检测PCA3的试剂盒(Progensa PCA3)，帮助临床医生决定对既往前列腺活检阴性的患者在随后的随访或诊治中是否需要重复前列腺穿刺活检以早期发现前列腺癌的出现，其原理是在直肠指检和前列腺按摩后(DRE)收集尿液标本，在体外进行核酸扩增，测量前列腺的lncRNA PCA3和PSA mRNA浓度.通过计算其比值(PCA3积分)及参考病人的其它症状决定是否有必要重复进行前列腺穿刺活检，该试剂盒得到了美国药品食品管理局(FDA)的批准[27].许多其他临床研究已经证明检测PCA3在PCa诊断以及判断预后中的价值[28].

对于乳腺癌患者，实时荧光定量PCR在血液中检测lncRNA RP11-445H22.4的敏感性和特异性可分别达到92%和74%,与临床上常用的血清癌胚抗原检测相比有明显的改善[29].

据报道，病人血浆中lncRNA POU3F3的表达水平可以作为潜在生物标志物，有助于食管鳞状细胞癌的诊断.

lncRNA CAHM在血浆中的水平与染色体上CAHM基因的甲基化水平呈负相关.CAHM基因在通常情况下处于一种高甲基化状态.在结直肠癌(CRC)时，随着肿瘤的发展，甲基化的CAHM基因释放到血浆的量明显增加.而同时，血浆中CAHM的水平明显降低.有望在实际工作中，通过同时检测CAHM和CAHM DNA的甲基化水平作为生物标志物用于CRC的筛查[18].

总的来说,lncRNAs在血液或其他体液中的检测可以作为特定类型癌症的标志物.一些lncRNAs也可能作为判断预后的标志物和用于观察治疗的效果.一些表达特异性较低但在癌症时表达异常的lncRNAs也可能被用于肿瘤的筛查.

3 lncRNAs作为肿瘤标志物的优势

已经证实，lncRNA的表达比蛋白质有更高的特异性.不仅如此，lncRNA往往表达在细胞分化的不同阶段[30].这些特征表明lncRNA的表达在时间、空间和表达水平上都受到严格的调控.

综合考虑，lncRNA应该是一种非常有前景的肿瘤标志物.随着核酸测序技术的发展，可以预见，将不断有新的lncRNAs作为肿瘤标志物涌现.通常用来检测蛋白质的技术，包括免疫组织化学，酶联免疫吸附法和免疫印迹技术首先需要抗体，抗体的特异性和有关的检测方法还需要时间来进行质量控制，这是一个耗时并昂贵的过程.利用多聚酶链反应或新一代测序等技术直接对核酸进行检测比蛋白质检测更为简捷，快速.所以lncRNA有很大的潜力成为新的肿瘤标志物.结合经典的蛋白类肿瘤标志物检测，血清lncRNAs的检测将提供一个更清晰的患者癌状态图片，包括分析肿瘤来源及分级分期，转移，观察治疗效果等.在体液，如血液、尿液中对lncRNA的检测，将对癌症的早期诊断及确定原发性肿瘤的来源提供帮助[31].

4 结语

一些lncRNAs在细胞中的表达比蛋白编码基因有更高的特异性.此外已经证明，lncRNAs往往严格表达在细胞分化的不同阶段.在病理条件下，如癌症，许多lncRNAs表达异常.使用聚合酶链反应，下一代测序等技术，异常表达的lncRNA比较容易在血液或其他体液(如尿中)检测或鉴定.随着有关lncRNA的知识不断增加，比如lncRNA在不同组织和癌症类型表达以及在肿瘤发生中所起作用的机理探讨，lncRNA可能成为新的肿瘤标志物，结合相关的蛋白标志物.lncRNAs未来的应用将会有巨大的潜力，尤其是在癌症的诊断、分析肿瘤来源及分级分期、转移及观察治疗效果等方面.

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Research on Large Non-coding RNA as Tumor Marker

FAN Xiaohang1,2,QIN Xin1,ZHANG Min1,ZHANG Wenjing1,LIAO Xiaofeng3*,GONG Wenrong1*
(1.Medical College,Hubei University of Arts and Science,Xiangyang 441053,China;2.Department of Pathophysiology,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030, China;3.Department of General Surgery,Affiliated Hospital of Hubei University of Arts and Science, Xiangyang 441020,China)

Most transcripts in the genome are non-coding RNAs(ncRNA)compared to the protein-coding mRNAs. Large non-coding RNA(lncRNA)refers to ncRNA with more than 200 nucleotides in length and seems to be expressed in a highly tissue specific and age-dependent manner.Notably,a very large number with more than 111,000 human annotated lncRNA transcripts are meanwhile described expressed in specific tissues and cell types.LncRNAs are involved in a variety of cellular processes that include the regulation of gene expression programs related to cell growth,differentiation,DNA replication,recombination and repair as well as cell migration.Here,we summarize and focus on lncRNAs expression and tumor,especially,the differentially expression of lncRNAs at various stages of cell differentiation.Further we summarize evidences that reveal the specific expression at various stages of cellular differentiation in a time-and space-dependent manner indicating that lncRNAs exhibit also a cell type and stage specific expression in cancer cells.The use of the high specificity of lncRNA expression will provide a very an important tool for diagnostics and perhaps therapeutic intervention. Thus,the detection of selected lncRNAs in blood samples or other tissue fluids will be very useful for early cancer diagnosis and for large-scale cancer screening.

Large non-coding RNA;Tumor marker;Tumor screening

Q522

A

2095-4476(2016)11-0084-05

（责任编辑：徐 杰）

2016-08-30；

2016-10-10

襄阳市科技局项目;湖北文理学院医学院基金项目(YXKY201403)

范晓航(1982— ),女,湖北襄阳人,湖北文理学院医学院讲师.

*共同通讯作者