阿德福韦酯治疗慢性乙肝后细胞免疫水平的临床研究

许茵，华忠，俞萍，戴亚萍，蒯守刚

（江苏省无锡市第五人民医院1.检验科，2.肝病科，江苏 无锡 214005）

阿德福韦酯治疗慢性乙肝后细胞免疫水平的临床研究

许茵1，华忠2，俞萍2，戴亚萍1，蒯守刚1

（江苏省无锡市第五人民医院1.检验科，2.肝病科，江苏 无锡 214005）

目的探讨阿德福韦酯治疗慢性乙肝（CHB）患者后免疫应答和细胞免疫状态。方法采用时间分辨法检测乙型肝炎病毒（HBV）血清标志物，酶联免疫吸附法检测白细胞介素-21（IL-21）水平，荧光定量聚合酶链反应检测血清HBV-DNA，流式细胞术检测HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和滤泡辅助性T淋巴细胞（Tfh）的变化。结果阿德福韦酯治疗72周后HBV-DNA水平下降，血清IL-21水平、外周血HBV特异性CTL和Tfh水平高于治疗前（P＜0.05），治疗后HBV-DNA转阴组和HBeAg转阴组中血清IL-21水平、外周血HBV特异性CTL、Tfh水平高于未转阴组（P＜0.05），而HBV-DNA转阴组和HBeAg转阴组各检测指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论阿德福韦酯治疗CHB可提高血清IL-21、HBV特异性CTL及Tfh水平，该变化可能与CHB患者抗病毒治疗后病毒性应答有关。

慢性乙肝；HBV-DNA水平；滤泡辅助性T淋巴细胞；HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞

全球约20亿人证明有乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染，其中3.5亿为慢性HBV感染。据2006年全国乙型肝炎流行病学调查推算，我国现有慢性HBV感染者约9 300万人，其中慢性乙型肝炎患者（chronic hepatitis B，CHB）约2 000万例。机体感染HBV后，机体的细胞免疫在病毒清除和肝细胞损害中起重要作用。慢性乙肝患者治疗的方法之一是利用核苷类药物抗病毒，其疗效与患者细胞免疫功能有关，细胞免疫状态在病毒清除过程中起重要作用[1]。本实验研究75例CHB患者经阿德福韦酯治疗72周后，HBV-DNA水平和细胞免疫水平的变化，探讨细胞免疫在抗病毒治疗过程中的作用。

1 资料与方法

1.1研究对象

选取2010年12月-2012年3月无锡市第五人民医院肝病科收治的75例CHB患者，符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》[2]的标准。纳入标准：乙肝表面抗原阳性、HBV-DNA＞1×103拷贝/ml，肝功能有不同程度的异常，肝组织学检查有肝炎病变。排除标准：甲肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒感染，自身免疫性疾病，使用过核苷类药物和干扰素等抗病毒药物或免疫调节剂。纳入患者均为人类白细胞抗原-A2（Human leukocyte antigen-A2，HLA-A2）阳性，其中男性44例（58.7%），女性31例（41.3%）；年龄21～60岁；平均病程（4.33±2.15）年。

1.2实验方法

1.2.1治疗方法CHB患者口服阿德福韦酯（正大天晴药业公司生产）10 mg，1次/d。按照2010年《慢性乙型肝炎防治指南》的标准，疗程≥72周。

1.2.2HBV血清标志物和HBV-DNA检测方法HBV血清标志物采用全自动时间分辨荧光免疫分析仪（1235-514AUTO-DELFTA），苏州新波生物技术有限公司试剂检测。HBV-DNA使用聚合酶链反应，上海科华生物工程股份有限公司试剂检测。

1.2.3人外周血单个核细胞的分离釆集患者及健康对照抗凝血，与等量液混匀后，将外周血稀释液与人外周血淋巴细胞分离液按比例沿离心管壁缓慢加入淋巴细胞分离液层，室温离心。用移液管缓慢吸出白色单个核细胞层，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤2次，离心后弃上清液。

1.2.4外周血滤泡辅助性T淋巴细胞（T follicular helper cells，Tfh）及特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）百分率的检测将上述PBS洗涤2次后的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）计数重悬，使100μl悬液中含1×106个细胞。分别加入抗人CD4-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate isomerⅠ，FITC）和抗人CXCR5-PerCP/Cy5.5流式抗体。室温避光孵育30 min后PBS洗涤2次，流式细胞仪检测CD4+CXCR5+细胞的百分率。加入抗人CD8-PerCP/ Cy5.5抗体、抗人HLA-A2-FITC抗体、抗人Pro5 MHC Pentamer A-PE流式抗体，室温避光孵育30 min后PBS洗涤2次，流式细胞仪检测HLA-A2+CD8+MHC+细胞的百分率。抗体均购自美国BD biosciences公司。

1.2.5外周血白细胞介素-21（Interleukin-21，IL-21）的检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法，试剂由美国ADL公司提供，检测仪器为北京德朗公司的酶标分析仪。

1.2.6肝功能检测采用日本奥林帕斯公司5400全自动生化分析仪，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1CHB患者治疗前后谷丙转氨酶、HBV-DNA、白细胞介素-21、HBV特异性CTL和Tfh的变化

75例CHB患者经阿德福韦酯治疗72周后，谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、HBV-DNA、IL-21、HBV特异性CTL和Tfh与治疗前比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），ALT和HBVDN下降，而IL-21、HBV特异性CTL和Tfh上升。见表1。

表1　CHB患者治疗前后ALT、HBV-DNA、IL-21、HBV特异性CTL和Tfh的变化（n=75±s）

表1　CHB患者治疗前后ALT、HBV-DNA、IL-21、HBV特异性CTL和Tfh的变化（n=75±s）

组别ALT/（IU/L）HBV-DNA/（log 10拷贝/ml）IL-21/（ng/L）HBV特异性CTL/%Tfh/%治疗前277.301±89.6116.542±0.81313.741±2.3130.363±0.0713.472±2.133治疗72周后36.530±5.2142.081±0.22243.612±15.0200.844±0.1136.073±1.581 t值3.9727.5648.5733.2724.511 P值0.0000.0000.0000.0000.000

2.2治疗后HBV-DNA阴转组与未转阴组IL-21、HBV特异性CTL和Tfh浓度变化

经阿德福韦酯治疗72周后，HBV-DNA转阴组与HBV-DNA未转阴组IL-21、HBV特异性CTL和Tfh比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），IL-21、HBV特异性CT和Tfh上升，HBV-DNA转阴组高于HBV-DNA未转阴组；乙型肝炎E抗原（hepatitis Be antigen，HBeAg）转阴组与HBeAg未转阴组IL-21、HBV特异性CTL和Tfh比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），HBeAg转阴组IL-21、HBV特异性CTL和Tfh高于HBeAg未转阴组。见表2、3。

表2　治疗后HBV-DNA阴转组与未转阴组IL-21、HBV特异性CTL和Tfh浓度变化（±s）

表2　治疗后HBV-DNA阴转组与未转阴组IL-21、HBV特异性CTL和Tfh浓度变化（±s）

组别IL-21/（ng/L）HBV特异性CTL/%Tfh/% HBV-DNA转阴组（n=54）42.672±15.1010.872±0.0624.974±2.413 HBV-DNA未转阴组（n=21）t值16.754±9.241 3.021 0.561±0.103 5.064 2.663±0.791 4.523 P值0.0000.0000.000

表3　治疗后HBeAg阴转组与未转阴组IL-21、HBV特异性CTL和Tfh浓度变化（±s）

表3　治疗后HBeAg阴转组与未转阴组IL-21、HBV特异性CTL和Tfh浓度变化（±s）

组别HBV特异性CTL/%Tfh/% HBeAg转阴组（n=19）0.983±0.0605.362±2.312 IL-21/（ng/L）39.833±17.142 HBeAg未转阴组（n=56）t值11.851±10.210 4.872 0.613±0.074 6.323 2.784±1.461 4.217 P值0.0000.000 0.000

3 讨论

阿德福韦酯是单磷酸腺苷的核苷酸类似物，在体内通过细胞激酶作用被磷酸化为具有活性作用的二磷酸阿德福韦，通过竞争脱氧腺苷三磷酸底物来抑制HBV-DNA逆转录酶活性，进入复制的HBVDNA内，终止病毒DNA链的延伸。

IL-21是由多种活化的CD4+T细胞（主要为Th17细胞、滤泡性辅助性T细胞）、自然杀伤细胞等分泌产生的细胞因子。IL-21可以通过增强CD8+T细胞的活化，增殖和效应功能调节细胞毒性的T淋巴细胞的分化。IL-21在乙型肝炎的发病过程及疾病转归中起重要作用[3]。Tfh可通过分泌IL-21增加病毒特异性CTL的增值[4-6]。

CHB患者抗病毒治疗后HBV-DNA转阴，HBeAg血清学转阴是CHB患者疗效较好的标志[7]。CHB患者抗病毒疗效与患者特异性细胞免疫有关。本研究采用阿德福韦酯治疗CHB患者72周，观察病毒学应答与HBV特异性CTL的关系，结果表明，治疗72周后患者IL-21和Tfh、HBV特异性CTL水平较治疗前明显升高。治疗后HBV-DNA转阴，HBeAg血清学转阴患者IL-21和Tfh、HBV特异性CTL高于治疗后HBV-DNA未转阴、HBeAg血清学未转阴的患者。

本实验结果表明，经阿德福韦酯治疗72周后，Tfh、HBV特异性CTL明显升高，说明抗病毒药物的治疗不仅直接抑制HBV复制[8]，而且还通过提高HBV特异性CTL水平发挥对HBV的清除作用，并且阿德福韦酯治疗慢性乙肝可增加Tfh的细胞比例和血清IL-21表达水平，Tfh可通过分泌IL-21进一步增加抗病毒特异性CTL细胞的增值活化。

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（童颖丹 编辑）

Cellular immune status in patients with chronic hepatitis B after treatment with Adefovir dipivoxil tablets

Yin Xu1,Zhong Hua2,Ping Yu2,Ya-ping Dai1,Shou-gang Kuai1
(1.Clinical Laboratory;2.Department of Hepatology,the Fifth People's Hospital of Wuxi,Wuxi,Jiangsu 214005,China)

Objective To investigate the dynamic variations of virological response and cellular immunity of patients with chronic hepatitis B(CHB)after Adefovir dipivoxil treatment.Methods Serum IL-21 level was analyzed by ELISA.HBV-DNA level was assayed by fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQPCR).Peripheral T lymphocyte subsets of HBV special CTL and T follicular helper cells(Tfh)were examined by flow cytometry(FACS).Results After treatment with Adefovir dipivoxil for 72 weeks,the serum HBV-DNA level was dramatically decreased,the levels of serum IL-21 and HBV special CTL and Tfh were significantly higher compared to those before treatment(P＜0.05).Moreover,the levels of serum IL-21 and HBV special CTL and Tfh in the HBV-DNA conversion and HBeAg conversion groups were significant higher than those in the HBV-DNA non-conversion and HBeAg non-conversion groups,respectively(P＜0.05).Conclusions The levels of serum IL-21,peripheral HBV special CTL and Tfh in CHB patients increase after thetreatment with Adefovir dipivoxil,which might be related with the cellular immune status of patients after antiviral treatment.

chronic hepatitis B;IL-21;Tfh;HBV special CTL

R512.62

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.019

1005-8982（2016）21-0094-03

2016-02-16

蒯守刚，E-mail：kuaishougang@163.com