南瓜醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

效碧亮 杨转萍 罗丽媛 孙 静

(兰州理工大学技术工程学院，甘肃 兰州 730050)



南瓜醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

效碧亮 杨转萍 罗丽媛 孙 静

(兰州理工大学技术工程学院，甘肃 兰州 730050)

以糯米和南瓜为原料，安琪酒曲为发酵菌剂，采用半固态发酵法制作南瓜醪糟，比较分析南瓜醪糟与纯米醪糟对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，研究发酵液不同稀释倍数、发酵时间、南瓜加入量对α-葡萄糖苷酶抑制作用的影响，同时测定南瓜醪糟的部分理化指标。结果表明，南瓜醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用，原液抑制率可达80%以上，且抑制活性较纯米醪糟发酵液强；发酵液不同稀释倍数、发酵时间及南瓜加入量对α-葡萄糖苷酶的抑制作用均有极显著影响，发酵时间为48 h时，抑制效果最好，南瓜加入量以米∶南瓜2∶1(g/g)为宜；南瓜醪糟中多糖为2.87 mg/g，还原糖为3.88%，VC为0.024 mg/100 g，蛋白质为0.071 2 mg/g，酒精为2 mL/g，pH为3.75。

南瓜醪糟；α-葡萄糖苷酶；抑制；成分含量

α-葡萄糖苷酶抑制剂在防治糖尿病、肥胖症、抗肿瘤和抗病毒等方面具有重要的作用[1]，尤其在治疗糖尿病方面，是一类新型的抗糖尿病药物。葡萄糖苷酶抑制剂的种类较多，按照其来源可以分为三类：微生物的代谢产物中得到，天然产物中提取以及化学法合成。但市场上降糖药物总体价格昂贵，且副作用明显。

因此，食疗是最安全、最经济、最放心的方法。目前资料表明具有抑制α-葡萄糖苷酶活性物质的食材有大豆(皂苷[2])、苦瓜[3]、山药[3]、苦荞(提取物)[4]和醪糟发酵液[5]等。相对大豆、苦瓜、山药和苦荞等的提取物而言，醪糟发酵液制作方便、经济实惠，且抑制效果较好，为70%左右。鲁战会等[5]曾对纯米醪糟发酵液抑制α-葡萄糖苷酶的作用进行过研究，但未见南瓜醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用的相关报道。为提高醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，本课题组大胆尝试改变醪糟发酵原料，将具有降糖作用的南瓜作为醪糟发酵原料之一，研究南瓜醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，提高其抑制率。南瓜作为主要原料制作醪糟不仅打破了传统醪糟制作原料的单一性，同时可向醪糟中引入更多生物活性物质，如南瓜多糖、钴、Vc、葫芦巴碱[6]等，其中南瓜多糖、钴均具有降糖作用[7]。鉴于此，本研究主要对南瓜醪糟降血糖特性做初步研究，比较南瓜醪糟与纯米醪糟对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及部分成分，旨在进一步证实醪糟发酵液可抑制α-葡萄糖苷酶这一理论，为醪糟发酵液抑制α-葡萄糖苷酶的相关理论研究向前迈步，同时为南瓜醪糟今后能成为辅助降血糖的功能性食品的开发与研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与设备

1.1.1 原材料

南瓜：黄金二号，市售；

糯米：市售；

酒曲：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 试剂

α-葡萄糖苷酶(100 U)和p-NPG(对硝基苯酚α-葡萄糖糖苷)：美国Sigma公司；

牛血清蛋白：美国Roche公司；

Na2CO3、磷酸二氢钠：分析纯，天津市鼎盛鑫化工有限公司；

磷酸盐缓冲液：准确称取7.801 5 g磷酸二氢钠，用蒸馏水溶解后定容至1 000 mL，所得溶液浓度为50 mmol/L；准确称取8.955 g磷酸氢二钠，用蒸馏水溶解后定容至500 mL，所得溶液浓度为50 mmol/L；取565 mL 50 mmol/L的磷酸二氢钠和435 mL 50 mmol/L的磷酸氢二钠充分混合，所得溶液为pH 6.7的磷酸盐缓冲液；

α-葡萄糖苷酶溶液：取α-葡萄糖苷酶100 U，牛血清蛋白877.2 mg，溶于50 mmol/L pH 6.7磷酸盐缓冲液中，用缓冲液定容至438 mL，所得酶浓度为22.8 U/100 mL；

对硝基苯酚α-葡萄糖苷溶液(p-NPG)：取p-NPG 0.150 7 g溶于磷酸盐缓冲液中，用缓冲溶液定容至500 mL，得10 mmol/Lp-NPG溶液。

1.1.3 设备

pH计：PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司；

高速离心机：TGL16M型，湖南凯达科学仪器有限公司；

紫外分光光度计：UV5100B型，上海元析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 醪糟发酵液的制备

(1) 南瓜醪糟发酵液：称取糯米20 g于清水中浸泡8 h，取出，加入切碎的南瓜10 g同糯米一起蒸20 min(同时将浸泡糯米水煮沸晾凉后待用)，之后转移到烧杯中迅速冷却至30 ℃左右。称取酒曲0.12 g溶于30 mL煮沸晾凉的泡米水中，缓缓加入盛有糯米和南瓜的烧杯中搅拌均匀，盖好保鲜膜于30 ℃水浴中发酵48 h。取发酵液20 mL，煮沸15 min，6 000 r/min离心10 min，取上清液置于4 ℃冰箱中待用。

(2) 纯米醪糟发酵液：不加南瓜，其它发酵工艺相同。

1.2.2 酶活抑制试验 取50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.7)100 μL，22.8 U/100 mLα-葡萄糖苷酶溶液150 μL，样品40 μL，37 ℃保温5 min后，加入10 mmol/Lp-NPG 750 μL，于37 ℃反应10 min后，最后加入2 mL 0.1 mol/L Na2CO3终止反应。测定400 nm处的吸光值。试验结果记录为B。以不加样品作为空白组，结果记为A。其中试验组的调零操作是将酶替换为灭活酶；而空白组是将酶和样品都以缓冲液替代。抑制率按式(1)计算：

(1)

式中：

W——抑制率，%；

A0——不加样品空白组的吸光值；

A1——加样品试验组的吸光值。

1.2.3 不同稀释倍数的醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制效果 为了研究不同稀释倍数发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，以及比较南瓜醪糟与纯米醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，对南瓜醪糟发酵与纯米醪糟发酵液均进行了0，20，40，60，80，100倍稀释，并测定各处理样对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

1.2.4 不同发酵时间的醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制效果 分别取发酵了24，30，36，42，48，54 h的南瓜醪糟发酵液，测定其对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

1.2.5 不同南瓜加入量的醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制效果 为了确定南瓜加入量是否对α-葡萄糖苷酶的抑制效果具有显著影响，设计了糯米∶南瓜(g/g)梯度分别为：1∶0，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，并分别测定了对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

1.2.6 成分测定

(1) 多糖的测定：采用苯酚—硫酸法[8]。

(2) 还原糖的测定：采用3,5-二硝基水杨酸法[9]。

(3) 蛋白质的测定：采用考马斯亮蓝法[9]。

(4) VC的测定：采用2,4-二硝基苯肼法[10]203-204。

(5) 酒精含量的测定：密度瓶法[10]30-31。

(6) 酸度的测定：采用pH计[10]211-212。

每次测定重复3次。

1.3 数据处理

采用SPSS软件处理。

2 结果与分析

2.1 不同稀释倍数的南瓜醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制效果

由图1可知，南瓜醪糟发酵液和纯米醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶活性均具有较好的抑制作用，南瓜醪糟发酵液抑制率达80%以上，纯米醪糟发酵液抑制率约为70%，前者比后者抑制率高出了10%。经方差分析表明稀释度对两种发酵液抑制率均具有极显著的影响，随着稀释度增加，两种醪糟发酵液对酶活抑制率均呈下降趋势，然而南瓜醪糟发酵液的抑制效果显著大于纯米醪糟，且其抑制率约以10%的速率下降，而纯米醪糟约以13%的速率下降，南瓜醪糟发酵液中抑制剂活性成分受稀释倍数的影响较纯米醪糟小，进一步说明南瓜作为醪糟原料可显著提高其发酵液抑制α-葡萄糖苷酶活性的效果。

不同字母表示差异极显著，P<0.01

Figure 1 The inhibition effect of the different dilute concentration of Laozao onα-glucosidase

2.2 不同发酵时间的醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制效果

由图2得知，在其他条件不变的情况下，随着发酵时间的延长，南瓜醪糟和纯米醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用均呈上升趋势，南瓜醪糟发酵液抑制率从40.712%增大到81.396%，而纯米醪糟的从20.523%增大到70.176%，进一步说明南瓜醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制效果更好，同时表明抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分在醪糟发酵过程中也会产生。为了确定南瓜醪糟发酵液最佳发酵时间，对结果进行了方差分析和多重比较，结果表明发酵时间对南瓜醪糟发酵液抑制α-葡萄糖苷酶的活性有极显著影响，图2表明发酵48 h和54 h的抑制作用无显著差异，故抑制效果最好的发酵时间可选择48 h，这一结果与南瓜醪糟发酵最佳发酵时间相吻合。

不同字母表示差异极显著，P<0.01

Figure 2 The inhibition effect of the different fermented time of pumpkin Laozao onα-glucosidase

2.3 不同南瓜量的醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制效果

经方差分析表明醪糟中南瓜加入量对α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有极显著影响，再次证实了南瓜的加入量可增强醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。图3表明，随着南瓜加入量的增加，醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈先上升后下降趋势，当南瓜加入量为糯米∶南瓜2∶1(g/g)时，发酵液抑制率达到最大。这一结果与南瓜醪糟发酵南瓜最佳加入量相吻合，由于醪糟的发酵主要靠糯米完成，若南瓜加入量太多，产品发酵品质较差，至于其抑制率会下降具体原因需后期进一步研究。

2.4 成分测定

由表1可知，醪糟中南瓜的加入丰富了其营养成分，例如南瓜多糖和维生素，其中南瓜醪糟多糖含量明显高于纯米醪糟，这主要是南瓜多糖的含量，由于南瓜多糖具有很好的降血糖作用，所以在对α-葡萄糖苷酶的抑制作用方面南瓜醪糟比纯米醪糟更稳定，抑制剂活性更高。从两者所含还原糖的量来看，南瓜醪糟为3.88%，纯米醪糟为8.67%，前者比后者低4.79%，有利于高血糖患者使用。其中酒精和pH值两者无较大差异，说明南瓜的加入对二者影响较小。

不同字母表示差异极显著，P<0.01

样品多糖/(mg·g-1)还原糖/%VC/(10-2mg·g-1)蛋白质/(mg·g-1)酒精/(mL·g-1)pH值南瓜醪糟2.87±0.063.88±0.070.02±0.000.07±0.002.09±0.003.81±0.14纯米醪糟2.25±0.018.67±0.20-0.04±0.002.00±0.003.75±0.14南瓜 6.08±0.081.24±0.029.79±0.040.14±0.00--

3 结论

研究结果表明南瓜醪糟发酵液对α-葡萄糖苷酶具有极强的抑制作用，抑制率达80%以上，且其抑制率较纯米醪糟发酵液高约10%。南瓜醪糟部分成分的测定再次证实了南瓜作为醪糟的原料之一不仅可丰富醪糟的营养成分和颜色，降低原糖含量，还进一步增强了抑制α-葡萄糖苷酶的稳定性和活性，此研究结果可为南瓜醪糟今后能成为辅助降血糖功能性食品的开发与研究提供理论支撑。然而，对南瓜醪糟中降糖活性物质定性、定量以及理化性质和降糖的机理却需更深入研究，为南瓜醪糟发酵液抑制α-葡萄糖苷酶的机理提供更有力的理论依据。

[1] BOW LIN T L, MCKOWN B J, KANG M S, et al. Potentiation of human lymphokine -activated killer cell activity by swainsonine, an inhibitor of glycoprotein processing[J]. Cancer Research, 1989, 49: 4 109-4 115.[2] 全吉淑, 尹学哲, 金明, 等. 大豆皂苷对α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究[J]. 中药材, 2003, 26(9): 654-656.

[3] 吴玥霖, 魏然, 曾里, 等. 四种天然产物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究[J]. 食品工业科技, 2010(9): 130-131.

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[10] 王永华, 张水华. 食品分析[M]. 2版. 北京: 中国轻工业出版社, 2011.

The inhibition effect onα-glucosidase from fermented supernatant of pumpkin laozao

XIAOBi-liangYANGZhuan-pingLUOLi-yuanSNUJing

(CollegeofTechnologyandEngineering,LanzhouUnivercityofTechnology,Gansu,Lanzhou730050,China)

Pumpkin with glutinous rice as raw material, lao-zao was made by semi solid fermentation. The inhibition of pumpkin lao-zao and pure rice lao-zao was compared, and the inhibition effect of fermented supernatant of the different concentrations and different fermented time and different adding amount of pumpkin were studied. Then, some physical and chemical indexes were determined. The result showed that pumpkin Lao-zao had significant inhibition effect on α-glucosidase, the inhibition rate of primal was higher than 75 percent, and the active of inhibitor of pumpkin Lao-zao was higher than pure rice Lao-zao. The fermented supernatant of the different concentrations and different fermented time and different adding amount of pumpkin had extremely significant effect on the inhibition effect ofα-glucosidase. Moreover, in the forty-eight hour，the inhibition effect was highest, the ratio of glutinous rice and pumpkin was appropriate as 2∶1(g/g). In pumpkin Lao-zao, polysaccharide is 2.87 mg/g, reducing sugar is 3.88%,VCis 0.024 mg/100 g, protein is 0.071 2 mg/g, alcohol is 2 mL/g, pH is 3.75.

the pumpkin Lao-zao;α-glucosidase; inhibition; composition content

甘肃省教育厅项目(编号：2015B-218)

效碧亮(1984—)，女，兰州理工大学技术工程学院讲师，硕士。E-mail: xiaobiliang840824@126.com

2016—08—08

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.002