食管癌前病变组织间质成纤维细胞的形态变化及生物学特征

徐志彬，袁丽，郑秀丽，王士杰，吴明利

(河北医科大学第四医院，石家庄050011)



食管癌前病变组织间质成纤维细胞的形态变化及生物学特征

徐志彬，袁丽，郑秀丽，王士杰，吴明利

(河北医科大学第四医院，石家庄050011)

目的 观察食管癌前病变组织间质成纤维细胞(AFs)的形态变化及生物学特征。方法 取食管癌组织、食管癌前病变组织、正常食管组织，采用胶原酶消化法制备食管癌组织间质成纤维细胞(CAFs)、AFs、正常食管组织间质成纤维细胞(NFs)，传代培养。观察3种细胞的表面形态，免疫组化染色后观察其免疫表型[角蛋白(CK)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)]，MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线，流式细胞技术检测细胞周期。结果 AFs的表面形态介于NFs和CAFs。3种细胞的CK表达均为阴性，Vimentin表达均为阳性。NFs α-SMA表达阴性，AFs、CAFs α-SMA表达均为阳性。AFs的增殖能力及细胞周期各期细胞所占比例亦介于NFs和CAFs。结论 AFs可能是NFs向CAFs转化的中间过渡阶段，其表面结构与生物学特性不同于NFs，与CAFs极其相似。

食管癌前病变；间质成纤维细胞；细胞形态；生物学特征

以往对食管癌的研究主要以癌细胞为基础，而对癌细胞所处的间质微环境未引起足够重视。食管癌组织间质成纤维细胞(CAFs)不仅参与食管癌细胞的增殖和侵袭[1～6]，在食管癌的复发和转移中亦扮演重要角色[7]。食管正常鳞状上皮向鳞状细胞癌转变的过程中有一个中间过渡阶段——鳞状上皮不典型增生阶段，而在正常食管组织间质成纤维细胞(NFs)向CAFs转变的过程中是否也存在不典型增生阶段鲜见报道。本研究观察食管癌前病变组织间质成纤维细胞(AFs)的形态变化及生物学特征。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选择2015～2016年我院手术切除的食管癌组织、食管癌前病变组织、正常食管组织各10例份。10例食管癌患者术前均未行放化疗，术后组织病理检查证实为低分化鳞状细胞癌。食管癌前病变组织取自行内镜下黏膜切除术或黏膜剥离术患者，组织病理检查证实为高级别上皮内瘤变；正常食管组织取自贲门癌患者癌旁正常鳞状上皮组织。FBS购自美国Hyclone公司；胶原酶Ⅱ购自美国Gibco公司；二甲基亚砜、四氮唑蓝购自美国Sigma公司；鼠抗人角蛋白(CK)单克隆抗体、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体、鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体购自北京西雅金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞培养及鉴定 ①胶原酶Ⅱ消化：将剪好的组织转移至培养瓶中，加入适量0.1%的胶原酶Ⅱ，于37 ℃ CO2培养箱中消化，直至在显微镜下观察到细胞团或独立的细胞后终止消化。收集细胞，制备细胞悬液。吸取部分细胞悬液接种于新的培养瓶中，加入适量新鲜培养液，继续培养，每2～3天换液一次，直到细胞基本爬满瓶底。②细胞传代：待细胞基本爬满瓶底，向培养瓶中加入适量胰蛋白酶-EDTA混合液消化1 min，于倒置显微镜下观察到细胞质回缩、细胞间缝隙增大，终止消化，用吸管反复吹打瓶底，收集细胞。③胰蛋白酶纯化：取部分细胞，制备细胞悬液。吸取部分细胞悬液接种于新鲜培养瓶中，加入适量0.25%的胰蛋白酶，显微镜下观察1～2 min，至成纤维细胞变圆、部分脱壁终止消化，用吸管轻轻吹打成纤维细胞生长的区域，收集吹打下来的细胞，常规传代培养。④细胞冻存与复苏：取对数生长期细胞进行消化，并收集于离心管中，取新鲜配制的细胞冻存液，逐滴加入离心管中，用吸管轻轻吹打，使细胞均匀，细胞密度为(3～4)×106个/mL。将细胞分装于塑料冻存管。将冻存管置于4 ℃冰箱2 h，转入-20 ℃冰箱4 h，再转入-80 ℃冰箱保存。实验前取出冻存管，迅速放入37 ℃水浴锅中，1 min内使其完全融化，取出细胞，离心弃上清，加入新的培养基，接种于培养瓶中，置于温箱中培养，次日换液。

1.3 细胞形态观察 将纯化后的贴壁细胞直接置于倒置显微镜下，观察细胞大体形态。取纯化后的第3代细胞制作细胞爬片，孵育1～2天。镜下观察细胞基本爬满后，常规清洗，95%乙醇固定20 min，晾干，4 ℃保存备用。将制作好的细胞爬片固定于载玻片上，向细胞爬片滴加1 mL瑞氏-吉姆萨染液，2 min后观察到有细胞着色，弃去染液，用D-Hanks液清洗干净，光镜下观察细胞着色情况。收集纯化后的第4代细胞，取细胞(1～2)×107个，常规消化洗涤后，转入1.5 mL离心管中，1 500 r/min离心8 min，用吸管轻轻吸取上清液，沿离心管侧壁轻轻加入2.5%戊二醛固定液1 mL，置于4 ℃冰箱固定4 h，磷酸盐缓冲液清洗15 min×3次，1%四氧化锇1～2 h，4 ℃冰箱保存。磷酸盐缓冲液清洗15 min×3次，梯度丙酮脱水，100%丙酮∶包埋液=1∶3 37 ℃过夜，用包埋剂将样品包埋在胶囊或包埋板里，置入烤箱，37 ℃ 24 h，然后用超薄切片机将样品切成厚约50 nm的切片，醋酸双氧铀染色30～45 min，柠檬酸铅染色5～30 min，透射电镜下观察细胞形态。

1.4 细胞免疫表型鉴定 如上制作细胞爬片，并将其固定于载玻片上，3% H2O2室温孵育10 min，PBS液漂洗5 min×3次，用含10%牛血清封闭液封闭30 min，弃去封闭液，加入一抗(CK或Vimentin或α-SMA)，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次，滴加二抗，湿盒中孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，DAB显色，室温反应10 min，蒸馏水漂洗1 min×2次，苏木素复染1 min，自来水洗10 min，95%乙醇脱水1～2 s，中性树胶封片，光镜下观察CK、Vimentin、α-SMA表达。

1.5 细胞生物学特征检测

1.5.1 细胞生长情况 采用四氮唑蓝比色法(MTT法)。取NFs、AFs、CAFs各4×103个，分别接种于96孔板中，每孔200 μL。每隔24 h向其中3孔加入MTT液10 μL，继续培养4 h终止培养，其余各孔继续培养，每日测3孔，连续测7天。设立与实验孔条件平行的空白孔，以空白孔调零，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度(A)值。

1.5.2 细胞周期 采用流式细胞术检测。取对数生长期的NFs、AFs、CAFs，接种于6孔板中，细胞密度为4×105个/孔，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每组设3个复孔。培养48 h，收集细胞，并调整细胞密度为1×107个/mL，取100 μL细胞悬液加入DNA染液(PI 50 μg/mL，RNA 酶10 μg/mL及1% Triton-X100 1 mL)，4 ℃冰箱中染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期。试验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 三种细胞形态变化 大体形态可见，NFs、AFs、CAFs培养2～3天即可见细胞贴壁，7天左右细胞生长迅速，20天左右即可爬满瓶底。首次传代与纯化后细胞生长较慢，7天左右才能爬满瓶底，细胞大部分为成纤维细胞，呈反射状或栅栏状生长，期间亦有上皮样细胞生长。以后每次传代与纯化后，细胞生长较快，2～3天即可爬满瓶底，混杂的上皮样细胞越来越少，第4代的成纤维细胞纯度即可达95%。冻存的成纤维细胞复苏后存活率高，生长状态良好，形态无变化。NFs：细胞间差异小，大小、形状基本一致，呈扁平长梭形，细胞间界限清楚，单层生长，存在密度抑制和接触抑制。AFs：大小、形状基本一致，排列不整，局部出现重叠生长的现象。CAFs：大小、形状不一，突起多少不定，生长密集杂乱，重叠生长，密度抑制和接触抑制消失。

光镜下可见，细胞核呈深紫色，细胞质呈淡粉色。NFs：形态规则，胞质染色均匀，椭圆形，位于胞质中央。AFs：形态不规则，胞质均匀，核大，部分胞核形状不规则。CAFs：形态不规则，胞质染色淡，胞核大，圆形，核仁明显。见插页Ⅱ图6。

透射电镜下可见，NFs：胞核形态规则，核大，居中，可见核糖体、高尔基体和内质网，胞质内可见散在微丝。AFs：胞核大而明显，细胞器发达，微丝呈片状分布，出现附着斑。CAFs：核大，形态不规则，切迹明显，核仁明显，胞质伸展，突起较多，胞质内细胞器发达，可见丰富的核糖体、高尔基体，粗面内质网扩张，微丝密布，局部形成微丝束，成团形成附着斑，可见大量微丝和致密斑。见插页Ⅱ图7。

2.2 细胞免疫表型 NFs、AFs、CAFs CK表达均阴性，Vimentin表达均阳性。NFs α-SMA表达阴性，AFs、CAFs α-SMA表达均阳性。

2.3 细胞生物学特征 NFs、AFs和CAFs均呈“S”形生长曲线，3～5天为对数生长期，细胞生长旺盛，AFs的增殖能力介于NFs和CAFs。见表1。CAFs S期、G0/G1细胞比例分别为(33.41±1.65)%、(37.96±2.02)%，AFs分别为(32.83±1.47)%、(45.43±2.91)%，NFs分别为(23.74±1.03)%、(51.46±3.74)%。AFs细胞周期各期细胞所占比例亦介于NFs和CAFs(P均<0.05)。

表1 三种细胞不同时间细胞增殖情况±s)

3 讨论

从正常组织到癌前病变，再进展至癌组织是一个漫长的病理过程，期间不仅瘤体内部的变化非常复杂，癌细胞所处的间质微环境在癌团的刺激下亦在变化，以适应癌团的生长、浸润和转移。成纤维细胞是间质微环境的主要成分，可分泌多种细胞因子和生长因子，其功能的活跃状态取决于其是否发生活化[8]。从NFs发展到活化的CAFs是否存在过渡阶段——AFs，AFs是否已先于CAFs发生活化，以及是否进一步转化为CAFs，目前鲜见报道。

曾伟伟等[9]研究发现，在食管癌前病变组织中不仅上皮组织发生了异常，相应间质组织中也出现了活化的间质成纤维细胞，这些表型活化的成纤维细胞在蛋白分泌功能上也存在差别。本研究结果显示，NFs、AFs、CAFs在细胞表面形态上无明显差别及特异性表现，但在内部结构的观察中发现：AFs与CAFs形态不规则，胞突多，细胞器发达，核糖体、内质网和高尔基体处于活跃状态，同时表现了一些特性，如出现大量附着斑及排列紊乱的微丝。NFs生长到一定密度后存在接触抑制现象，但AFs与CAFs不存在密度抑制和接触抑制现象，可重叠生长，这一点与NFs明显不同。CAFs是一组含有平滑肌肌动蛋白的成纤维细胞，在形态及生物学行为上同时具有平滑肌细胞和成纤维细胞的双重特性。α-SMA是由肌上皮细胞表达的一种细胞骨架蛋白，是肌成纤维细胞收缩表型的典型标志。本研究CAFs CK阴性、Vimentin阳性、α-SMA阳性，属VA型，与刘伯新等[10]研究结果一致；而AFs的免疫表型与CAFs的免疫表型相同，亦属VA型。关于AFs培养鉴定的报道较少，国内仅见孙艳等[11]对乳腺癌前病变成纤维细胞进行过鉴定。本研究中，NFs、AFs和CAFs CK表达均阴性，Vimentin表达均阳性，而AFs和CAFs α-SMA均阳性，说明AFs和CAFs均保留了成纤维细胞的特征，同时兼具平滑肌细胞的特征。

有研究认为，CAFs可与癌细胞相互作用[12～14]，CAFs通过分泌EGF、TGF-β、IGF等细胞因子到细胞外基质，从而促进癌细胞增殖；反之，癌细胞分泌TGF-β1和HGF等因子可刺激癌相关纤维母细胞增殖。本研究发现，NFs增殖缓慢，细胞多停留在G1期；NFs、AFs和CAFs的S期所占百分比依次增高，CAFs在恶性上皮细胞刺激下，增殖明显加快，S期细胞所占比例最高；AFs增殖能力介于NFs和CAFs，这一结果预示正常食管鳞状上皮细胞、不典型增生上皮细胞和癌细胞对其邻近的成纤维细胞产生的作用是有差别的。

综上所述，AFs可能是NFs向CAFs转化的中间过渡阶段，其免疫表型和生物学特征更接近于CAFs。

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河北省医学科学研究重点课题计划(20160656)。

吴明利(E-mail： xzblxh@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.009

R735.1

A

1002-266X(2016)40-0032-03

2015-10-23)