内蒙古呼伦贝尔高寒地区奶牛口蹄疫免疫抗体跟踪检测及防控对策

乌日根达来，程延彬*，李 伟，张宝辉

(1.海拉尔农牧场管理局，内蒙古 海拉尔区 021008；2.特泥河农牧场，内蒙古 陈巴尔虎旗 021024；3.哈达图农牧场，内蒙古 陈巴尔虎旗 021511)



牛病防治

内蒙古呼伦贝尔高寒地区奶牛口蹄疫免疫抗体跟踪检测及防控对策

乌日根达来1，程延彬1*，李 伟2，张宝辉3

(1.海拉尔农牧场管理局，内蒙古 海拉尔区 021008；2.特泥河农牧场，内蒙古 陈巴尔虎旗 021024；3.哈达图农牧场，内蒙古 陈巴尔虎旗 021511)

呼伦贝尔地区奶牛口蹄疫免疫按自治区的要求，一年进行三次免疫，即每四个月免疫一次。主要对口蹄疫亚洲I型、A型和O型的免疫。口蹄疫的一个重要特性是耐寒不耐热。呼伦贝尔市地处东经115°31′～126°04′、北纬47°05′～53°20′。温带北部，其气候特点为大陆性气候显著，冬季寒冷漫长，最冷月(1月)平均气温在-18℃～-35℃之间，全市大部分地区年平均气温在0℃以下。1、2月是口蹄疫高发期，如果免疫密度不够，抗体水平低下，很可能发生疫情。通过进行抗体检测，掌握群体免疫抗体水平，对补针和下一步进行免疫起到关键作用。2015年10、11月和2016年1月，分三期对两组180头牛进行了口蹄疫免疫抗体检测，对犊牛第一次免疫应答抗体水平的低高时期及奶牛抗体水平的跟踪检测，分析寒冷时期牛产生抗体时间、从低峰到高峰时间段及衰退时间的抗体效价，对海拉尔垦区奶牛整体防控提供了宝贵的资料。

1 实验动物与检测方法

1.1 实验动物

从内蒙古呼伦贝尔市海拉尔农牧场管理局下属哈达图农牧场、特泥河农牧场两个牧场挑选60～80日龄犊牛各45头；育成奶牛各45头，共计180头牛，分犊牛组和奶牛组，每组90头牛。

口蹄疫亚洲I型、O型、A型三价灭活疫苗，内蒙古金宇生物制药厂生产。于2015年9月25日，对两组牛注射口蹄疫三价疫苗，每头牛1 ml。于2015年10月25日,11月25日，2016年1月10日分别三次采血进行抗体检测。

1.2 检测方法

1)检测材料：①亚洲I型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒、A型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒、O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(中牧实业股份有限公司兰州生药厂生产)。②移液器:5～50 μL移液器、0.2～10 μL移液器、50～200 μL移液器、50～300 μL 12道移液器各3把；移液枪尖 (若干)；③抗原抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)15块,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。注:抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴30 s,晾干,待用；d、超纯水 ,无离子水或蒸馏水；e、被检血清。

2)试剂准备

①包被缓冲液的配置

从试剂盒中取出碳酸盐缓冲液胶囊，并小心打开，将胶囊内粉末全部倒入烧杯中，并加入无离子水100 mL，搅拌均匀，使之充分溶解；然后4℃存放，备用。

②洗涤液的配置

从试剂盒取出标有25xPBST的浓缩洗液，如有结晶形成，可微热溶化，若洗液瓶为2 L容积，可量取浓缩洗液80 mL加入1 920 mL无离子水中(1∶25稀释)，充分混匀，并用NaOH将pH值调至7.4。

③底物溶液的配置

用100 mL无离子水将试剂盒中的柠檬酸-磷酸盐片剂充分溶解，量取溶解后的溶液50 mL，加入邻苯二胺(OPD)片剂，充分溶解，10 mL每瓶分装，避光-20℃保存。使用前需避光溶化，在临用前每10 mL底物溶液加入100 μL的 3%的双氧水(H2O2)。

3)操作步骤

①包被ELISA板：

将口蹄疫病毒兔抗血清按照1∶1 000的比例加入之前配置的包被缓冲液当中进行稀释，制成包被液，充分混匀后，在ELISA板上的每孔内加入包被液50 μL，振荡1分钟后封板，室温过夜。

②抗原抗体反应：

在U型反应板上以每孔50 μL量用1倍的PBST将待检血清从1:4开始做2倍的连续稀释至1∶512。同时，按图示A11-H11孔中稀释阳性对照血清，于A12、B12孔中稀释阴性对照血清，然后将用1倍PBST稀释至使用浓度的口蹄疫病毒抗原加入到各孔中，被检血清孔及阴阳性对照孔每孔50 μL，病毒抗原对照孔加100μL。振荡1分钟，充分混匀后，封板，4℃过夜。加入病毒抗原后，被检血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释(O型口蹄疫抗体检测时，稀释度比亚洲I型低一个滴度)。

③第二日，将ELISA板中的液体弃去，并用1倍的PBST对ELISA反应板进行5次洗板，在吸水纸上拍干，然后，将U型板(抗原抗体反应板)从4℃取出室温放置5分钟后，将每孔血清病毒混合物依次转移至拍干的ELISA板上的相对应孔，每孔50 μL，封板，置入37℃恒温培养箱中温育1 h。

④1 h后，再将ELISA板中的液体弃去，并用1倍的PBST对ELISA反应板进行5次洗板，在吸水纸上拍干。用豚鼠抗血清稀释液将口蹄疫病毒豚鼠抗血清稀释至1∶1 000浓度，并在ELISA反应板中每孔加入50 μL，封板，置入37℃恒温培养箱中温育1小时。

⑤1 h后，再将ELISA板中的液体弃去，并用1倍的PBST对ELISA反应板进行5次洗板，在吸水纸上拍干。用1倍的PBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至1∶1 000浓度(O型为1∶500)，并在ELISA反应板中每孔加入50μL，封板，置入37℃中温育1小时。

⑥1h后，再将ELISA板中的液体弃去，并用1倍的PBST对ELISA反应板进行5次洗板，拍干后，在ELISA反应板中每孔加50μL底物溶液(加双氧水)，置入37℃恒温培养箱中避光温育15分钟。到时间后，每孔直接再加入50μL终止液，终止反应，并立即在492 nm波长下读取光吸收值(OD492 nm值)。

2 检测结果

2.1 犊牛组检测结果

1)第一次检测结果(30 d)

亚洲I型：效价(抗体滴度)1∶32～1：64为42份，1∶64～1∶90为48份，平均效价为(保护)43%。

O型：效价(抗体滴度)1∶32～1∶64为36份，1∶64～1∶90为54份，平均效价为(保护)51%。

A型：效价(抗体滴度)1∶32～1∶46为27份，1∶46:～1∶64为53份，平均效价为(保护)40%。

2)第二次检测结果(60 d)

亚洲I型：效价(抗体滴度)1∶32为6份，1∶64为23份，1∶90为25份，1∶108为36份，平均效价为(保护)63%。

O型：效价(抗体滴度)1∶32～1∶64为17份，1∶64～1∶90为46份，1∶90～1∶108为27份，平均效价为(保护)60%。

图1 犊牛组抗体接触结果

A型：效价(抗体滴度)1∶32～1∶64为15份，1∶64～1∶90为45份，1∶90～1∶108为30份，平均效价为(保护)65%。

3)第三次检测结果(100 d)

亚洲I型：效价(抗体滴度)1∶32～1∶64为41份，1∶64～1∶90为32份，1∶90～1∶108为17份，平均效价为(保护)53%。

O型：效价(抗体滴度)1∶32～1∶64为24份，1∶64～1∶90为32份，1∶90～1∶108为34份，平均效价为(保护)51%。

A型：效价(抗体滴度)1∶32～1∶64为19份，1∶64～1∶90为51份，1∶90～1∶08为20份，平均效价为(保护)52%。

2.2 奶牛组检测结果

1)第一次检测结果(30 d)

亚洲I型：效价(抗体滴度)1∶32～1∶64为4份，1∶64～1∶90为23份，1∶90～1∶128为63份，平均效价为(保护)73%。

O型：效价(抗体滴度)1∶32～1∶64为10份，1∶64～1∶90为18份，1∶90～1∶128为62份，平均效价为(保护)71%。

A型：效价(抗体滴度)1∶32～1∶64为7份，1∶64～1∶90为26份，1∶90～1∶128为57份，平均效价为(保护)69%。

图2 奶牛组抗体检测结果

2)第二次检测结果(60 d)

亚洲I型：效价(抗体滴度)1∶90～1∶128为8份，1∶128以上为82份，平均效价为(保护)95%。

O型：效价(抗体滴度)1∶90～1∶128为3份，1∶128以上为87份，平均效价为(保护)97%。

A型：效价(抗体滴度)1∶90～1∶128为11份，1∶128以上为79份，平均效价为(保护)93%。

3)第三次检测结果(100 d)

亚洲I型：效价(抗体滴度)1∶64～1∶90为22份，1∶90～1∶128为58份，1∶128以上10份，平均效价为(保护)75%。

O型：效价(抗体滴度)1∶32～1∶64为17份，1∶64～1∶90为49份，1∶90～1∶128为21份，1∶128以上为3份，平均效价为(保护)63%。

A型：效价(抗体滴度)1∶32～1∶64为19份，1∶64～1∶90为51份，1∶90～1∶128为19份，1∶128以上为1份，平均效价为(保护)60%

3 讨论

1)对犊牛初次注射疫苗，产生初次应答反应，所产生的抗体量不多。犊牛组30、60、100天三种疫苗平均抗体效价为45%、62%、52%。最高峰60天时的效价才为62%，然后逐渐下降。100天之内的平均保护率为50%左右，远低于疫病抗感染抗体效价的70%以上水平。如果一旦遭遇口蹄疫流行，很难保证不发生疫情。因此，应该于第一次免疫注射30天时再进行一次加强免疫，刺激原有的体内留下的免疫记忆细胞，使机体产生强抗体。

2)奶牛组的90头牛是在1月、5月份注射过疫苗，实验注射疫苗后，机体产生抗原的再次应答反应。机体在特异性回忆反应下迅速产生强抗体，并使抗体持续时间长。在本次实验中30、60、100天三种疫苗平均抗体效价为71%、95%、66%。强抗体持续时间为90天左右，到100天后开始逐渐衰退。这时候应该考虑进行加强免疫。

3)口蹄疫病毒的一个特性是耐寒不耐热，在夏季很少流行，在冬季气候寒冷时候流行比较多见。呼伦贝尔地区的1、2月是最寒冷的时候，平均温度达零下30～40℃左右，是口蹄疫病毒活跃期和疫病流行的危险时期。对奶牛进行计划免疫时，一年的第三次免疫应该安排在11月末进行，从12月末开始产生强抗体，到第二年1月中旬抗体水平达到高峰，能有效抵抗疫病的侵害，能安全渡过1、2月份危险期。疫苗注射1个月时，进行采血抗体检测，监测产生抗体情况，评估整群牛的抗体水平，如抗体水平达不到立即进行加强免疫。

2016-06-10

2016-06-15

乌日根达来(1966-)，男，高级兽医师，本科，主要从事动物疫病防控及诊治。

*通讯作者：程延彬(1976-)，男，内蒙古呼伦贝尔市人，畜牧师，硕士研究生，主要从事反刍动物营养研究及畜牧业规划管理等工作。

S823

A

1001-9111(2016)05-0086-03