肿瘤基因治疗病毒载体相关研究生物安全问题浅析

张忠献，王鹏举，王尧河

(郑州大学基础医学院、郑州大学科技部细胞与基因治疗国际联合研究中心，河南 郑州 450052)



肿瘤基因治疗病毒载体相关研究生物安全问题浅析

张忠献，王鹏举，王尧河

(郑州大学基础医学院、郑州大学科技部细胞与基因治疗国际联合研究中心，河南 郑州 450052)

近年来，肿瘤基因治疗无论在科研领域还是在临床应用中都取得突破进展。随着越来越多的以病毒为载体肿瘤基因治疗药物被批准上市，该领域的研究会快速增长。然而，病毒载体经过改造之后，对人类的致病性很弱，使科研工作者很容易忽视其潜在的生物安全风险。本文就常见病毒载体所涉及的生物安全方面的管理规定及潜在风险进行分析总结。

基因治疗；病毒载体；生物安全

2003年重组人p53腺病毒注射液作为世界上第1个获准上市的肿瘤基因治疗药在我国上市[1]，至2012年欧洲药监局批准了第1个在西方国家被批准上市的基因治疗产品Glybera[2]和2015年美国食品药品管理局的批准生产的imlygic用于皮肤癌治疗等，肿瘤基因治疗无论在科研领域还是在临床应用中都取得很多突破进展[3]。病毒载体作为肿瘤基因治疗中外源基因导入靶细胞并有效表达从而实现治疗疾病的一种非常有效的工具。随着基础医学和分子病毒学的发展，人们对病毒载体的进一步改造完善，其在基因治疗中发挥着越来越重要的作用。对病毒载体的不断优化和改良，也在世界各地的实验室里不间断进行着。载体中不必要的病毒基因去除可明显减轻细胞毒性和免疫原性，还可避免产生可复制的病毒颗粒和人体感染病毒的危险。在此基因上，外源基因的定位整合可提高基因治疗的效果。然而，病毒载体安全性的提高，更容易让科研工作者们忽略其潜在的生物安全风险。本文就常见病毒载体的生物安全属性及其风险进行浅析。

1 常见病毒载体的基本属性

常见的病毒载体既有非致性的腺相关病毒载体，也有可引起艾滋病的人类免疫缺陷病毒(HIV)等。各种病毒载体母体的基本生物学特性及致病性见表1[4]。

2 常见病毒载体生物安全管理法律法规要求

早在基因工程研究领域快速发展的初期，为促进我国生物技术的研究与开发，加强基因工程工作的安全管理，我国就颁布《基因工程安全管理办法》(国家科委第17号)[5]。至2006年，为加强病原微生物实验室生物安全管理，规范病原微生物实验活动，在《病原微生物实验室生物安全管理条例》[6]的基础上，制订了《人间传染的病原微生物名录》[7]，对病原微生物实验室生物安全管理做了明确的规定。特别是针对使用人类病毒的重组体作了具体的说明：在新的法规未出台的情况下，暂时遵循的原则是：首先，禁止2个不同病原体之间进行完整基因组的重组；其次，对于对人类致病的病毒，如有疫苗株，只允许疫苗株用于外源基因的表达载体；另外，对操作防护条件也提出了明确的要求，具有复制能力的重组活病毒(复制型重组病毒)，要求不低于其母本病毒；复制缺陷型病毒不得低于BSL-2的防护条件。常见病毒载体的生物安全分类见表2。

表1 常见病毒载体基本特性

表2 常见病毒载体的生物安全分类

3 病毒载体科研相关的生物安全风险分析

病毒载体的实验室生物安全主要包含病毒载体母体以及载体构建实验或生产过程中使用和诱发的各类基因片段、重组基因片段。由于生命科学和生物技术的特殊性，病毒载体母体及各类基因片段一旦进入环境，就会对人体健康和生态安全造成潜在威胁。

病毒载体的构建及生产，为了开发更加高效的载体以及引入有治疗作用的基因，在分子生物学水平对病毒基因及治疗基因进行编辑整合。未转染之前的基因编辑一般在普通实验室下完成，处理不当或不及时处理，可导致各种基因片段暴露于实验室。暴露的基因片段为重组提供的模板和可能，如果污染了我们已经构建好的具有特定疗效的新型基因治疗产品，那么因为污染有可能造成全部的工作毁于一旦。另外，对环境的染污还有可能造成潜在有风险的新的微生物的出现。

新构建病毒载体疗效评价，新的病毒载体构建好之后一般先在细胞水平评价体外疗效，然后进行动物实验评价体内疗效。细胞水平的评价常做的实验是病毒的杀伤和复制实验。这2个实验容易忽视的关键点是感染细胞之后剩余的少量病毒及实验结束之后细胞培养板中残存的病毒。肿瘤病毒基因治疗的动物实验，目前以皮下肿瘤模型为主。瘤内注射治疗时，由于病毒的注射可以使瘤内压力都加，可导致病毒从瘤内射出，造成科研工作人员的面部暴露。动物的挣扎或工作人员出现差错容易发生注射针头刺伤也是很重要的风险因素之一。另外，手术、取材及尸体处理等都是潜在的风险。

4 防控措施

有针对性开展生物安全知识教育，增强科研工作者的生物安全意识。魏明等[8]调查某医学院本科生动物实验安全防护知识知晓情况，结果显示50.3%医学生对动物实验安全的概念不清，52.3%学生对实验室感染事件、实验室安全认识不够，86.9%学生不了解实验室生物安全法律法规。不难看出，实验室生物安全事故多为人为事故的原因。痘苗病毒作为最常用的载体之一，魏强等[9]通过文献分析了痘苗病毒实验室获得性感染病例的状况及特征，发现52.9%病例是在进行动物实验过程中意外针刺手部而导致感染，70.6%病例感染部位发生在手部，暴露后平均5.1天出现感染症状。仅2例病例在出现意外情况后及时采取了现场冲洗、消毒等应急处理措施，及时就医，并如实向医生说明工作中接触痘苗病毒情况。多数病例在发生意外后，并未采取应急措施，麻痹大意、继续工作，事后在出现症状后方去就诊。由于一个实验室所采用的病毒载体都是确定的，所以其生物安全教育培训的内容就需要有针对性、更详细。

做好日常防护及应急预案。病毒载体的弱致病性，长期致使科研工作者们忽视其生物安全。例如，对肿瘤动物模型进行治疗时，带上防护面具对动物治疗，实验操作的方便程度就会大降低。这也是日常防护难以有效执行的一个原因。另外，日常防护用具的选择也十分重要。现在市场上各种产品质量良莠不齐，高质量的防护用具有利于日常防护的执行。另外，科研工作者发生意外后及时进行必要的现场应急处置，及时就诊并向医生提供研究背景信息应是预防和控制痘苗病毒实验室获得性感染的重要方面。

[1] 关大刚，郑旭.重组人p53腺病毒注射液(今又生)临床研究进展[J].现代肿瘤医学，2011，19(12)：2560-2563.

[2] 石亮，刘云波.腺相关病毒的特性及应用进展[J].医学综述，2016,22(11):2088-2092.

[3] 孙友松.2015年10月美国和欧盟新批准药物概述[J].药学进展，2015,39(10):794-800.

[4] 黄文林,徐志凯,董小平.分子病毒学[M].北京：人民卫生出版社,2016:384-388.

[5] 基因工程安全管理办法[J].中华医学杂志,1994,74(9):577-580.

[6] 病原微生物实验室生物安全管理条例[J].畜牧兽医科技信息,2004,(12):19-21.

[7] 卫生部关于印发《人间传染的病原微生物名录》的通知[J].中华人民共和国卫生部公报,2006,(2):32-52.

[8] 魏明,倪嘉莉,赵冬,等.医学院本科生动物实验安全防护知识调查[J].现代医药卫生,2013,29(15):2296-2297.

[9] 魏强，卢选成，武桂珍.痘苗病毒实验室获得性感染病例的状况及特征分析[J].中华实验和临床病毒学杂志,2013,27(1):73-75.

张忠献(1984-)，男，硕士，助理实验师，主要从事细胞与基因治疗相关研究。E-mail：zhzhx110@126.com

王尧河(1965-)，男，博士，教授，主要从事细胞与基因治疗相关研究。E-mail：yaohewang@zzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.05.029

R730.54

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1673-5412(2016)05-0456-03

2016-01-22)