水稻抗稻瘟病基因分子检测及抗性评价

周 鹏，涂诗航，董瑞霞，王洪飞，郑 轶，王志赋，张水金，游晴如，董练飞，黄庭旭，郑家团

(福建省农业科学院水稻研究所，福建 福州 350018)



水稻抗稻瘟病基因分子检测及抗性评价

周 鹏，涂诗航，董瑞霞，王洪飞，郑 轶，王志赋，张水金，游晴如，董练飞，黄庭旭，郑家团*

(福建省农业科学院水稻研究所，福建 福州 350018)

为预防单一稻瘟病基因抗性容易丧失，培育持久性抗稻瘟病水稻新品种，本研究利用4份保持系、6份恢复系和3份常规稻品种为受体亲本，以75-1-127(含有稻瘟病基因Pi9)和U19(含有抗稻瘟病基因Pi25)为供体亲本，经过多代选择，获得了48份田间高代材料。叶瘟抗性鉴定结果表明，48份高代株系材料中5份表现抗，25份表现为中抗，其余均表现为中感及以上。分子标记辅助选择结果表明，19份高代株系含有抗稻瘟病基因Pi9，5份含有抗稻瘟病基因Pi25。

水稻；叶瘟；抗性；分子标记

水稻是全球一半以上人口赖以生存的基本食粮，而中国是世界第一水稻生产国和消费国。21世纪以来，中国水稻种植面积无增长，单产提高慢，总产量增长少，近15年来仅增长7.1%。目前，影响水稻生产的病害主要有3种，稻瘟病是其中之一，每年可造成10%～30%的损失，同时对稻米品质也造成不良影响，对我国粮食安全生产造成了巨大的危害[1]。因此选育抗稻瘟病的杂交水稻新品种长期以来是育种家的主要目标之一。某一品种或抗病基因的大面积单一化应用会导致病稻瘟病菌某一特定优势小种群的形成和发展，最终导致稻瘟病的大面积暴发和流行[2]。福建省是稻瘟病发病较严重的地区，近年来，在参加福建省或全国南方水稻区试的品种中，抗性品种的比例很低，抗性差严重地影响了杂交稻组合的推广应用。鉴于稻瘟病的危害性，目前，福建省水稻品种审定对新育成品种的抗稻瘟病性实行一票否决，很多高产、优质杂交稻新品种因抗瘟性不达标而不能通过品种审定[3]。

水稻抗稻瘟病基因Pi9来源于小粒野生稻，位于水稻6号染色体上[4]，对来自13个国家43个稻瘟病小种表现出很高的抗性[5]，是目前利用分子标记辅助选择技术改良稻瘟病抗性使用最广泛的主效抗性基因之一。源自籼稻品种“谷梅2号”的抗稻瘟病主效基因Pi25[6]，位于水稻6号染色体上，对中国稻瘟病菌系92-183有较强的叶瘟和穗颈瘟抗性，近年来相继报道了采用分子标记技术将Pi25基因转育到栽培稻中[7-10]。

本研究同时以含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻材料75-1-127和含有抗稻瘟病基因Pi25的中间材料U19为抗源选育杂交水稻恢复系和保持系，获得了48份水稻高代新株系，通过在福建省上杭县茶地乡稻瘟病重发区进行稻瘟病自然诱发鉴定，评价其稻瘟病抗性水平，同时通过分子标记检测探明其抗性基因来源，为以后配制抗病杂交水稻新品种及抗病新材料的创制奠定基础，也预防了单一抗性基因的抗性易丧失的风险。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以三系杂交水稻的4份保持系福稻B、福农B、14B和元丰B，6份恢复系X5、X9、蜀恢527、明恢86、闽恢3301和内恢9802，以及3份常规稻华航丝苗、繁9和胜巴丝苗为受体亲本，以抗瘟材料75-1-127(含有稻瘟病抗性基因Pi9)和U19(由中国水稻研究所庄杰云提供，含有稻瘟病抗性基因Pi25)为抗源育成的48份水稻新品系为抗性鉴定材料；以2个供体亲本为抗性对照，以广陆矮4号为感病对照。

1.2 叶瘟田间自然诱发鉴定

2014-2015年，田间叶瘟自然诱发鉴定圃设在福建省上杭县茶地鉴定圃进行。每个品种播种1条，3个重复，5月26日播种，每条播种100粒，四周设诱发行，以广陆矮4号为诱发品种。不喷施农药，施氮肥，施用量高于普通大田20%。

1.3 叶瘟的调查方法

出苗后30 d人工喷施菌液使充分发病。叶瘟的调查在开始出现病斑后10 ～15 d进行，按0～9级标准调查病情，调查方法参照郑轶等[11]的方法。在供试材料的2 a抗性水平中，以级数最高的为该材料的稻瘟病综合抗性水平。

1.4 水稻基因组DNA的提取

采取出苗后20 d的鲜嫩叶片5 g，采用孙川等[12]的方法制备水稻基因组DNA。

1.5 抗病基因PCR检测

抗性基因Pi9的检测选用分子标记pB8，抗性基因Pi25的检测选用连锁STS标记Si13070D，由上海生物工程技术公司合成。抗性基因Pi9的检测参照张荟等[13]的方法。抗性基因Pi25的检测PCR反应体系为10 μL，其中2×TaqPCR Master Mix混合酶5 μL，模板DNA 1 μL，10 μmol·L-1的引物各0.5 μL，加ddH20补足10 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸7 min，4℃保存，产物通过6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔点样1.6 μL，用GetRed核酸染料染色，用BIO-RAD Imaging System成像系统成像分析。

2 结果与分析

2.1 48份水稻新品系叶瘟抗性水平

对48份水稻新品系在田间自然诱发鉴定圃的叶瘟抗性鉴定结果表1，其中5份水稻新品系叶瘟抗性表现为2级，占10.42%；14份抗性表现为3级，占29.17%；11份抗性表现为4级，占22.92%；7份抗性表现为5级，占15.58%；5份抗性表现为6级，占10.42%；5份抗性表现为7级，占10.42%；1份抗性表现为9级，占2.08%。图1显示了部分材料和抗感对照田间发病情况，抗感株系在病区的抗感界限分明。

表1 48份水稻新品系叶瘟抗性水平

2.2 不同抗源来源的水稻新品系的抗性比较

2个不同抗源育成的后代株系的抗性比较结果见表2。以75-1-127为抗源育成了30个株系，其中抗性达到抗水平的3个，中抗水平的株系17个，中感及以上水平的株系10个，达到中抗以上水平的株系约占66.67%；以U19为抗源育成了10个株系，其中抗性达到中抗水平的6个，中感及以上水平的株系5个，达到中抗以上水平的株系约占54.55%；以双抗源育成了7个株系，其中抗性达到抗水平的4个，中感水平的株系3个，达到中抗以上水平的株系约占57.14%。

表2 不同抗源来源的水稻新品系抗性比较

Table 2 Blast-resistance of new rice lines derived from different resistance donors

抗源不同抗性水平新品系数量/个抗(R)中抗(MR)中感(MS)感(S)高感(HS)合计/个中抗以上新品系所占比例/%75⁃1⁃127317271306667U1906230115455双抗源4030075714

2.3 48份新品系的抗性基因的检测分析

利用与Pi9基因紧密连锁的分子标记pB8对37份以75-1-127为抗源选育的高代株系材料进行分子检测，获得19份含有抗性基因Pi9的株系(图2)，其中保持系12份，恢复系7份。19份株系材料的田间编号是BC177、BC203、BC309、BC311、BC617、BC901、EB511、EB557、EB558、EB559、EB560、EB561、EDF66、EDF69、EDF75、EDF77、EDF78、EDF79、EDF82。

利用与Pi25基因紧密连锁的分子标记Si13070D进行亲本间的多态性分析，结果表明，抗性对照谷梅2号、抗源U19能扩增出相同大小的单一条带，与其他亲本材料的扩增条带存在多态性(图3)，结果清晰，因此可以选择Si13070D标记对高代材料进行分子标记检测。对18份以U19为抗源选育的高代株系材料进行分子检测，获得5份含有抗性基因Pi25的株系(图4)，其中保持系材料3份，恢复系材料2份。5份株系的田间编号分别是BC153、BC623、BC801、EDF80、EDF81。

3 讨论与结论

稻瘟病是世界性水稻最具毁灭性的病害之一。实践证明，选育和种植抗病品种是控制该病害最经济有效的方法[14]。福建省是稻瘟病发生流行较严重的稻区之一，从1983年开展稻瘟病育种为中心的科技公关以来，育成了一大批水稻材料[15]。近10年以来，福建省共审定杂交水稻新品种168个，其中中抗以上品种24个，米质达部颁三级及以上的品种5个(数据来源于国家水稻数据中心。http://www.ricedata.cn/variety/)。育种材料各世代的抗病性鉴定是抗性育种的重要环节，研究表明[16-17]，对大量品系采用病圃自然发病的方法，可从大量材料中筛选出抗源材料供育种使用。随着育种技术综合应用的发展和育种水平的提高，超高产、强抗性杂交稻新品种的出世将为期不远。本课题组近几年通过重病区抗性自然诱发鉴定、分子标记辅助选择技术筛选了近2万份水稻育种材料及亲本，获得了一大批抗性优异的材料，大大提高了育种效率，取得了良好的效果。相关分析结果表明[11,18]，颈瘟鉴定的平均级与叶瘟的最高级和平均级呈极显著正相关，表明叶瘟与颈瘟相关非常密切，在苗期鉴定叶瘟发病重的组合，颈瘟发病也重。因此，为了减少工作量，本研究选择在苗期对高代材料进行稻瘟病抗性鉴定，淘汰感病株系，重点选育抗病株系，达到事半功倍的效果。在本研究中，叶瘟抗性鉴定及分子标记检测结果不相一致，含有Pi9抗性基因的BC311株系却表现为感稻瘟病，其可能与遗传背景及抗病基因的纯合程度相关；表现为中抗的BC127、BC325、ERK42、ER537、ER538、ER558却未检测出抗稻瘟病基因，其可能遗传了福农B、华航丝苗的抗稻瘟病基因。探秘福农B含有的稻瘟病基因是本课题组的下一步目标。在以后的育种实践中，应该坚持广泛收集鉴定抗病资源，丰富品种的抗性遗传背景，并长期跟踪抗性材料的抗性变化趋势，通过抗源多元化来增加品种的抗病年限。

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(责任编辑：林海清)

Molecular Detection and Resistance Determination of Rice Blast-resistance Genes

ZHOU Peng,TU Shi-hang,DONG Rui-xia,WANG Hong-fei,ZHENG Yi,WANG Zhi-fu,ZHANG Shui-jin,YOU Qing-ru,DONG Lian-fei,HUANG Ting-xu,ZHENG Jia-tuan*

(InstituteofRice,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350018,China)

To avoid a possible loss of blast-resistance in rice when a single resistance gene was dependent upon for the disease prevention, new rice varieties with durable rice blast-resistance were cultivated. Forty-eight field materials of advanced-generation were obtained through a multiple-generation selection from the crosses using 4 maintainer lines, 6 restorer lines and 3 conventional rice varieties as receptor parents with 75-1-127 (harboring blast genePi9) and U19 (harboring blast resistance genePi25) as donor parents. Evaluated by their resistance to the leaf blast disease, 5 lines were classified as highly resistant, 25 moderately resistant, and the remainders moderately or highly susceptible varieties. A marker-assisted selection showed that, among them, 19 advanced-generation lines carried blast-resistance genePi9, and 5 had blast-resistance genePi25.

rice; leaf blast; blast-resistance; molecular marker

2016-03-11初稿；2016-05-18修改稿

周鹏(1988-)，男，硕士研究生，助理研究员，研究方向：水稻遗传育种

*通讯作者：郑家团(1958-)，男，研究员，研究方向：水稻遗传育种(E-mail:superrice63@163.com)

福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2015R1021-2)；国家863计划项目(2011AA10A101)；福建省财政专项——福建省农业科学院科技创新团队建设项目(CXTD-2-1312)；福建省现代农业水稻产业技术体系项目(闽财指[2014]1032)；福建省农业科学院青年人才创新基金(2011QB-13)

Q 343

A

1008-0384(2016)09-962-04

周鹏，涂诗航，董瑞霞，等.水稻抗稻瘟病基因分子检测及抗性评价[J].福建农业学报，2016，31(9)：962-965.

ZHOU P，TU S-H，DONG R-X，et al.Molecular Detection and Resistance Determination of Rice Blast-resistance Genes[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(9)：962-965.