水稻条纹病毒外壳蛋白自身互作的活性区段研究

兰汉红

(闽南师范大学生物科学与技术学院，福建 漳州 363000)



水稻条纹病毒外壳蛋白自身互作的活性区段研究

兰汉红

(闽南师范大学生物科学与技术学院，福建 漳州 363000)

水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RSV)的外壳蛋白(coat protein，CP)参与病毒转录、复制等多个生物学过程。病毒蛋白之间的互作对病毒侵染活性非常重要，在明确RSV外壳蛋白CP能够自身互作的基础上，通过构建CP蛋白N端、M区段和C端(CP-N、CP-M和CP-C)的酵母表达载体，利用酵母双杂交系统确定外壳蛋白CP自身互作的活性区段。结果表明，N端和C端第1～81个氨基酸是参与水稻条纹病毒CP蛋白自身互作的活性区段。这一研究结果不仅有助于加深理解RSV CP蛋白在病毒基因组稳定、复制过程中的作用，也有助于加深了解RSV、寄主和传播介体之间关系。

水稻条纹病毒；外壳蛋白；酵母双杂交；蛋白互作；活性区段

近年来由水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RSV)引起的水稻条纹叶枯病给亚洲等地区的水稻生产带来巨大危害[1]。RSV由介体昆虫灰飞虱Laodelphaxstriatellus以持久增殖型方式传播，并可经卵传播给后代灰飞虱[2]。水稻感染RSV后植株表现出褪绿条纹，在生长早期感病的水稻还会矮化，严重的出现褐色坏死条纹甚至导致植株死亡[3]。RSV是纤细病毒属Tenuivirus的代表成员，其基因组由4条单链RNA组成。RNA1仅有1个ORF，采用负义编码策略编码依赖RNA的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)[4]；RNA2-4均有2个ORF，采用双义编码策略分别编码2个蛋白。RNA2的毒义链和互补链分别编码NS2和NSvc2蛋白；RNA3的毒义链和互补链分别编码沉默抑制子蛋白NS3和外壳蛋白CP；RNA4的毒义链和互补链分别编码病害特异蛋白SP和运动蛋白MP[5-6]。研究表明，CP在病毒侵染过程中发挥重要功能，其含量高低与寄主病症的严重度成正相关，因此推测CP蛋白是致病相关蛋白[7]。另外，RSV抗血清免疫胶体金标记和Western blot检测显示，在水稻叶绿体、细胞质、细胞核、叶肉组织细胞壁的胞间连丝以及RSV介体灰飞虱体内均发现CP的存在，据此推测CP也可能与病毒的复制和运输有关[8]。

关于病毒编码的外壳蛋白CP自身互作已有许多报道。Liu等利用酵母双杂交技术研究发现水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)的外壳蛋白P10存在自身互作，并且确定N端的前230个氨基酸是互作的关键区段，但是P10是否能通过自身互作形成病毒的外层还需要进一步研究[9]。大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus，SMV)CP能够自身互作，互作的关键区域位于CP的C端，并通过一些位点的氨基酸替换找到与CP自身互作相关的重要位点[10]。丙肝病毒、马堡病毒、艾滋病病毒、仙台病毒、SARS病毒和汉坦病毒等均发现外壳蛋白的自身互作[11-15]。对负链病毒的研究很大一部分集中在病毒的核壳蛋白复合体RNP上，因为RNP是其复制与转录的唯一活性形式。然而，对RSV的外壳蛋白CP的了解相对较少，如CP如何与病毒RNA结合形成RNP，CP是否也与其他负链病毒的N蛋白那样能够自身互作以及互作的活性部位等尚未探明。本研究利用酵母双杂交系统鉴定RSV CP蛋白自身互作的功能区段，结果发现RSV CP蛋白N端和C端第1～81个氨基酸是其自身互作的关键区段。这一研究结果将有助于了解RSV CP蛋白在介体昆虫传毒和侵染植物过程中的作用和机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

酵母双杂交试剂盒购自Clontech公司；Phusion高保真聚合酶购自Thermo公司；克隆载体pMD18-T和限制性内切酶SpeI、BamHI购于TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司；含有RSV CP基因的质粒pGBK-CP和pGAD-CP为福建农林大学植物病毒研究所惠赠。根据pGBK-CP质粒中CP基因序列，设计用于扩增N端1～483 bp(CP-N)、中间M区段243～726 bp(CP-M)、C端489～969 bp(CP-C)的片段引物。序列如下：

CP-N5：5′-GG ACTAGT ATG GGT ACC AAC AAG CCA GCC AC-3′(SpeI)；

CP-N3：5′-CG GGATCC ATA GTC CCA CAG CAG GTT GTC AC-3′(BamHI)；

CP-M5：5′-GG ACTAGT GTG AGA GAT GTC ACC AAG AAA GT-3(SpeI)；

CP-M3：5′-CG GGATCC ATC CTC CTT CTT CTT GTC AAT C-3′(BamHI)；

CP-C5：5′-GG ACTAGTG TTC CAC AAT ACA TCA AAC TGG AG-3(SpeI)；

CP-C3：5′-CG GGATCC CTA GTC ATC TGC ACC TTC TG-3′(BamHI)。

1.2 载体构建

利用Phusion聚合酶对RSV CP基因的N端CP-N、M区段CP-M、C端CP-C进行PCR扩增。PCR反应体系和程序参照鹿连明[16]。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化回收；回收产物连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取单菌落接种于液体LB培养基中培养并提取质粒，用SpeI和BamHI进行双酶切；双酶切后回收目的条带，用T4 DNA连接酶连接到酵母表达载体pGADT7和pGBKT7并转化大肠杆菌，提取质粒酶切和测序验证。重组酵母表达载体分别命名为pGAD-CP-N、pGAD-CP-M和pGAD-CP-C，以及pGBK-CP-N、pGBK-CP-M和pGBK-CP-C。

1.3 自激活和酵母双杂交

根据Clontech公司的酵母转化手册，将pGAD-CP-N、pGAD-CP-M、pGAD-CP-C以及阳性对照pCL1和阴性对照pGADT7分别转化酵母菌AH109并涂布SD/Leu-、SD/Leu-His-、SD/Leu-Ade-平板。pGBK-CP-N、pGBK-CP-M、pGBK-CP-C转化产物分别涂布SD/Trp-、SD/Trp-His-、SD/Trp-Ade-营养缺陷型平板。于30℃培养箱倒置培养3～4 d，并用无菌牙签挑取SD/Leu-和SD/Trp-平板上生长的菌落，分别转接到SD/Leu-/X-α-Gal和SD/Trp-/X-α-Gal平板上，观察不同营养缺陷型培养基上菌落生长情况及菌落变蓝情况，鉴定蛋白有无自激活活性。

将pGAD-CP-N/pGBK-CP、pGAD-CP-M/pGBK-CP、pGAD-CP-C/pGBK-CP、pGBK-CP-M/pGAD-CP、pGBK-CP-C/pGAD-CP、pGBK-CP-N/pGAD-CP以及阳性对照质粒pGBKT7-53/pGADT7-T和阴性对照质粒pGADT7-T/ pGBKT7-Lam两两共转化酵母AH109细胞。将转化产物分别涂布SD/Leu-Trp-、SD/Leu-Trp-His-、SD/Leu-Trp-His-Ade-/X-α-Gal营养缺陷型培养基，于培养箱30℃倒置培养3～4 d，观察菌落生长情况和菌落变蓝情况，检测两蛋白之间的互作情况，从而确定CP外壳蛋白自身互作的活性区段。

2 结果与分析

2.1 酵母双杂交自激活活性检测

结果表明，与阴性对照pGADT7转化产物一致，转化产物pGAD-CP-N、pGAD-CP-M、pGAD-CP-C在SD/Leu-培养基上均能正常生长，在SD/Trp-和SD/Leu-Ade-培养基上均无菌落生长，在SD/Leu-/X-α-Gal培养基上菌落不变蓝(图1)；而阳性对照pCL1转化产物在SD/Leu-、SD/Trp-和SD/Leu-Ade-培养基上均能正常生长，且在SD/Leu-/X-α-Gal培养基上菌落正常生长并变蓝(图1)。pGBK-CP-N、pGBK-CP-M、pGBK-CP-C转化产物在SD/Trp-培养基上均能正常生长，在SD/Leu-和SD/Trp-Ade-培养基上均无菌落生长，在SD/Trp-/X-α-Gal培养基上菌落不变蓝(结果未显示)。因此，CP-N、CP-M、CP-C蛋白均不具有自激活活性。

2.2 酵母双杂交确定外壳蛋白CP自身互作的活性区段

酵母双杂结果表明，pGAD-CP-N/pGBK-CP、pGAD-CP-M/pGBK-CP、pGAD-CP-C/pGBK-CP、pGBK-CP-N/pGAD-CP、pGBK-CP-M/pGAD-CP、pGBK-CP-C/pGAD-CP两两共转化产物均能在二缺选择性培养基SD/-Leu-Trp上生长(图2)，该结果与阳性对照pGADT7-T/pGBKT7-53共转化产物和阴性对照pGADT7-T/pGBKT7-Lam共转化产物菌落生长情况相同(图2)。除了pGAD-CP-N/pGBK-CP、pGBK-CP-N/pGAD-CP、pGAD-CP-C/pGBK-CP、pGBK-CP-C/pGAD-CP共转化产物和阳性对照pGADT7-T/pGBKT7-53共转化产物能在三缺SD/-Leu-Trp-His培养基上生长及在四缺显色SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal培养基上生长且显蓝色外，其余的两两共转化产物都不能在三缺和四缺显色培养基上生长(图2)。因此，水稻条纹病毒外壳蛋白CP全长能够与CP蛋白N端(CP-N)、C端(CP-C)互作，初步推测水稻条纹病毒外壳蛋白CP自身互作的活性区段位于N端和C端第1～81个氨基酸内。

为了进一步验证CP蛋白N端和C端81个氨基酸是其自身互作的活性部位，将重组质粒pGAD-CP-N/pGBK-CP-N、pGAD-CP-C/pGBCK-CP-C共转化酵母菌AH109，观察在营养缺陷型培养基生长情况。结果显示，pGAD-CP-N/pGBK-CP-N、pGAD-CP-C/pGBK-CP-C共转化产物在二缺SD/-Leu-Trp、三缺SD/-Leu-Trp-His及四缺显色SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal培养基都能够生长，且在四缺显色培养基上能显蓝色，与阳性对照pGADT7-T/pGBKT7-53共转化产物的生长情况相同(图3)。

综上，试验结果表明，水稻条纹病毒外壳蛋白CP蛋白N端和C端第1～81个氨基酸是其CP自身互作的活性区段。

3 讨 论

对外壳蛋白的自身互作已有很多相关的报道，比如丙肝病毒、马堡病毒、艾滋病病毒、仙台病毒和SARS病毒等[11-15]。其中研究最多最系统的是布尼亚病毒科的汉坦病毒[17]。和同科的其他成员一样，汉坦病毒属于负链RNA病毒，其基因组分成3段，分别为L、M和S。核壳蛋白复合体RNP是其具有转录和复制活性的唯一形式，而RNP包括病毒基因组RNA、N蛋白、RdRp和可能的其他成分[18]。N蛋白只包裹病毒基因组RNA及其互补链，但不包裹病毒mRNA。一系列的研究表明，汉坦病毒的N蛋白有两个自身互作位点，大肠杆菌表达的汉坦病毒N蛋白可以形成二聚体、三聚体或多聚体，而其中最稳定的是三聚体形式[19]。最近，MIA等研究表明，N蛋白单体和二聚体与RNA结合时虽然可以识别病毒RNA的5′端结构，但这种结合不稳定，且对盐浓度很敏感；然而N蛋白的三聚体形式可以特异地识别病毒RNA的5′端和3′端结构，且这种结合十分稳定[19]。因为所有布尼亚病毒科成员5′端和3′端都有十分保守的互补序列，可以形成一个锅柄结构，所以三聚体对病毒RNA的5′端和3′端的特异识别很可能是一种病毒用来区别自身RNA与宿主RNA以及自身基因组RNA与自身mRNA的一种机制。布尼亚病毒科有5个属，即布尼亚病毒属、汉坦病毒属、内罗华病毒属、白蛉热病毒属和番茄斑萎病毒属，许多病毒属都有N蛋白自身互作的报道[18]。虽然缺少直接的证据，但有些试验结果表明，这些互作可能有着十分重要的意义。比如，对于布尼亚病毒而言，当N蛋白被突变而不能自身互作时，它就不能支持人工构建的该病毒的微型基因组的复制。不同属病毒在互作位点以及稳定的多聚体形式上并不相同。白蛉热病毒只存在N端互作位点，而其他属病毒一般存在两个互作位点。汉坦病毒属N蛋白以三聚体最为稳定，而白蛉热病毒似乎主要以二聚体形式存在。N蛋白自身互作特点的差异似乎与各病毒属之间亲缘关系的远近相对应。比如布尼亚病毒属N蛋白在自身互作上与番茄斑萎病毒属表现十分相似[20]。

RSV是纤细病毒属代表成员，因为其在基因组结构及表达策略上与布尼亚病毒科十分相近，并且某些基因在序列上与该科病毒有一定的同源性，一般认为它在进化上与布尼亚病毒科相近。邓萍等研究发现，RSV CP蛋白 C′端氨基酸区域对其自身互作是必需的，缺失或破坏该结构会导致CP无法实现自身互作[21]。本研究进一步发现，RSV CP蛋白除了C端81个氨基酸，N端 81个氨基酸同样具有自身互作功能。因此，RSV CP蛋白互作模式上类似于汉坦病毒的N蛋白，该两个位点的互作模式可能与CP如何结合病毒核酸密切相关。因此，进一步验证这种互作的真实性和互作模式，找到互作关键的氨基酸位点，并研究这种互作在病毒基因组稳定、复制过程中的意义，将会进一步加深我们对RSV、寄主和传播介体之间关系的了解。

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(责任编辑：柯文辉)

Research of Fonctuonal Region Involved in the Self-interaction of Rice Stripe Virus Coat Protein

LAN Han-hong

(SchoolofBiologicalSciencesandBiotechnology,MinnanNormalUniversity,Zhangzhou,Fujian363000,China)

Coat protein of Rice stripe virus plays important roles in several biological processes, such as viral transcription and replication. Interactions among viral proteins are essential for viral infection activity on host and insect vectors. In the present study, yeast two-hybrid system was used to detect the functional region inolving in the self-interaction of the RSV coat protein (CP). It was revealed that N-and C-terminal 81 amino acid residues played an essential role in self-interaction of RSV CP. Our results will be contributed to better understanding not only for functions of CP on viral stabilization and replication in insect vectors or host plants, but also for the relationship among virus, insect vectors and host plants.

rice stripe virus; coat protein; yeast two-hybrid; protein interaction; functional region

2016-05-12初稿；2016-07-05修改稿

兰汉红(1982-)，男，博士，讲师，研究方向：分子病毒学(E-mail: lanhanh@163.com)

国家自然科学基金(31601613)；闽南师范大学博士基金项目(2006L21607)

S 435

A

1008-0384(2016)09-957-05

兰汉红.水稻条纹病毒外壳蛋白自身互作的活性区段研究[J].福建农业学报，2016，31(9)：957-961.

LAN H-H.Research of Fonctuonal Region Involved in the Self-interaction of Rice Stripe Virus Coat Protein[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(9)：957-961.