青花菜BoBURP2基因的克隆与表达分析

章燕如, 许 鑫, 祝 琦, 周秀倩, 俞可可, 龚 秀, 蒋 明

(台州学院生命科学学院，浙江 椒江 318000)



青花菜BoBURP2基因的克隆与表达分析

章燕如, 许 鑫, 祝 琦, 周秀倩, 俞可可, 龚 秀, 蒋 明*

(台州学院生命科学学院，浙江 椒江 318000)

BURP是植物特有蛋白，在生长发育和抗逆反应中起着重要作用。本研究以青花菜为材料，利用PCR克隆到1个BURP基因，命名为BoBURP2。测序结果表明，BoBURP2的基因组DNA全长为1 218 bp，具1个内含子，编码区全长为840 bp，编码279个氨基酸；序列比对结果表明，该基因与BURP家族成员RD22具有较高的同源性。系统发育分析结果表明，BoBURP2与甘蓝、芜菁和甘蓝型油菜的同源序列相似性最高，在发育树上聚为一组，与醉蝶花的相似性最低，亲缘关系最远。RT-PCR结果表明，BoBURP2的表达受NaCl和干旱胁迫的诱导，表达量分别在24 h和48 h时达到最大值，暗示该基因与这2种逆境响应相关。青花菜BoBURP2的克隆与表达分析，为后续基因功能的鉴定和抗逆分子育种奠定了基础。

青花菜；BoBURP2；RD22；克隆；表达

青花菜Brassicaoleraceavar.italica又名青花椰菜、西兰花、茎椰菜和绿菜花等，为十字花科Cruciferae芸薹属一年生或两年生草本作物，为甘蓝B.oleracea的一个变种[1-2]。青花菜花球富含营养成分，其中包括维生素、胡萝卜素、钙、磷、铁、钾、锌、锰等，同时含有丰富的萝卜硫素Sulforaphane、4-甲基亚磺酰丁基硫苷Glucoraphanin和类黄酮Flavonoids等成分，在预防癌症及心血管疾病中起着重要作用，因此，青花菜已成为深受人们喜爱的保健蔬菜作物之一[3-4]。但近年来，随着土壤盐渍化、干旱和全球变暖的日趋严重，青花菜生产受到一定的制约，甚至严重影响该蔬菜的生产，造成产量和品质下降。我国的青花菜种质资源十分匮乏，寻找优质的靶标基因用于分子育种，是解决青花菜育种材料短缺的重要途径之一。

BURP在植物中以基因家族的形式存在，在生长发育和抗逆反应中起着重要作用。BURP这一名称源自BNM2(Brassicanapusmicrospore-derived embryo)、USP(Unknown seed protein)、RD22(Responsive to dehydration 22)、PG1β(Beta subunit of polygalacturonase isoenzyme 1)4种蛋白的首字母[5]。其中的RD22为脱水应答蛋白，是植物特有蛋白，在其C端含一个保守的BURP结构域[6]；由Yamaguchi-Shinozaki等[7]首次从失水处理的拟南芥Arabidopsisthaliana中鉴定得到，是植物重要的抗逆基因。Northern杂交试验结果表明，RD22基因的表达受盐和水分胁迫的诱导，而与冷、热胁迫无明显关系[8]。近年来，已从西伯利亚蓼Polygonumsibricum、盐穗木Halostachyscaspica和柽柳Tamarixchinensis等植物中克隆到RD22基因[9-11]，但在青花菜中尚未报道。本研究以青花菜为材料，在克隆得到BoBURP2基因的基础上，利用生物信息学方法对其进行序列分析，并采用RT-PCR研究其在干旱和盐胁迫下的表达模式，以期为该基因的功能鉴定及青花菜抗逆分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用青花菜品种“优秀”为试验材料，采集新鲜叶片用于DNA的提取。幼苗培育至2叶1心期时，分别移栽到300 mmol·L-1的NaCl、15%的PEG-6000溶液中，胁迫0 、12 、24 、48 、72 h时采集叶片，用于RNA的提取。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA、RNA的提取及cDNA的合成 DNA的提取采用试剂盒法，基因组DNA小量抽提试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(碧云天)，试验操作根据其提供的说明书进行。RNA的提取采用Trizol法；cDNA的合成采用TaKaRa公司的试剂盒，第一链和第二链的合成按说明书进行。

1.2.2 青花菜BoBURP2基因的克隆 根据NCBI数据库发布的BURP基因序列设计PCR引物，上、下游引物的名称和序列分别为BoBURP2UP：5′-ATG GCT TCT TTG CGA TTC TCT GTC-3′和BoBURP2DN：5′-CTA CTT TGC TAC CCA CAC AAT GTT ATC AA-3′，由北京鼎国生物技术有限公司合成，用无菌ddH2O配成20 μmol·L-1的溶液备用。分别以基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系中依次加入以下试剂：10×PCR缓冲液 2 μL， dNTPs 0.5 μL，上、下游引物各0.25 μL，40 ng模板，2 U· μL-1的Taq酶0.4 μL，加入无菌ddH2O至终体积20 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸2 min，31个循环后，72℃继续延伸10 min。PCR扩增结束后，将产物全部点样于1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

1.2.3 PCR产物的回收、转化和测序 PCR产物经电泳检测后，用洁净的刀片割取含目的条带的胶块，用碧云天生物技术研究所的“DNA凝胶回收试剂盒”回收，试验操作根据说明书进行。取1.5 μL PCR回收产物与pMD 19T载体连接，将连接产物导入大肠杆菌受体细胞(北京全式金生物技术有限公司)，经转化、培养和菌液PCR验证后，各取3个阳性克隆用于测序。

1.2.4 序列分析 利用DNAMAN5.2.2、SMART在线工具(http://smart.embl.de)和Compute PI/Mw在线工具(http://web.expasy.org/compute)对BoBURP2基因及其编码蛋白进行理化性质分析[12]。为了研究BoBURP2的进化地位，从NCBI数据库中下载甘蓝型油菜B.napus(登录号：CDY48863.1)、甘蓝(XP_013590120.1)、芜菁(B.rapa)(XP_009147906.1)、拟南芥(NP_175357.1)、亚麻荠Camelinasativa(XP_010461769.1)、玉山筷子芥A.lyratasubsp.lyrata(XP_002891490.1)、荠菜Capsellarubella(XP_006304086.1)和醉蝶花Tarenayahassleriana(XP_010527370.1)等8种十字花科及其近缘植物的BURP序列。用Clustalx 1.81进行序列对比，再利用Mega 5.1软件构建进化树[13]。

1.2.5 基因表达分析 根据BoBURP2基因序列，设计RT-PCR引物，上、游引物分别为5′-AGG CAC AAA CGT CAA GAA AG-3′和5′-AGA TCT GCA TTA GAC GCT ATT G-3′，分别用等量的各处理及对照cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系同1.2.2的基因克隆，退火温度改为54.3℃，循环中的延伸时间改为60 s，其他不变。以青花菜肌动蛋白基因为内标，上、下游引物序列分别为5′-TCT CGA TGG AAG AGC TGG TT-3′和5′-GAT CCT TAC CGA GGG AGG TT-3′，扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55.6℃退火45 s，32个循环；72℃最后延伸10 min。PCR结束后，产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳、拍照和记录，试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 BoBURP2基因及其编码蛋白的特征

测序结果表明，BoBURP2基因的DNA全长为1 218 bp，具有1个内含子，长度为378 bp，位于+55～432 bp处，符合内含子GT-AG法则。该基因编码区域长840 bp，编码279个氨基酸。NCBI序列比对结果表明，该基因与RD22的相似性最高。经Compute PI/Mw在线工具预测，BoBURP2的分子质量为32 019.2 Da，理论pI值为9.05，不稳定系数为36.17，蛋白质的热稳定性指数为82.76，GRAVY值为-0.208，说明该蛋白为亲水性蛋白。通过NCBI的Blast程序分析发现该蛋白的C端含有1个保守的BURP结构域，位于+55～+279处(图1)。

2.2 BoBURP2及同源序列的比对分析

为研究BoBURP2的进化地位，从NCBI数据库下载了8种十字花科及其近缘植物的BURP序列。用Clustalx 1.81进行序列的多重对比(图2)，再利用Mega 5.1软件构建进化树(图3)。序列比对结果表明，8条蛋白质序列含有276～281个氨基酸残基，序列之间的相似性较高，仅个别氨基酸存在差别，说明RD22在进化上十分保守。青花菜BoBURP2与甘蓝BURP的相似性最高，达99%，与甘蓝型油菜和芜菁BURP的相似性次之，为98%，其与不同属植物之间的相似性则相对较低，如与拟南芥和玉山筷子芥BURP的相似性分别为78%和77%，与醉蝶花BURP的相似性仅为61%。青花菜、芜菁、甘蓝及甘蓝型油菜的BURP序列进行比对，结果表明，甘蓝在+11～+13位发生3个氨基酸(FHT)残基的缺失，芜菁在+178位发生1个残基(Q)的插入现象，其他变异发生在+25(Q⟺H)、+180(H⟺Y)和+194位(A⟺T)。同为南芥属的拟南芥和玉山筷子芥的BURP之间仅5个位点发生变异，分别位于+36、+45、+131、+179、+210处；醉蝶花的BURP与其他同源序列之间的差异较大，在+18～+19、+178～+180和+138位发生3次缺失，在+46～+51位有6个氨基酸残基(TSLNKE)的插入。

2.3 BoBURP2的系统发育分析

BoBURP2及其同源蛋白序列的总遗传距离为0.237，青花菜和甘蓝BURP的遗传距离0.004，序列之间的相似性最高，在进化树上聚为一支。甘蓝型油菜与芜菁BURP的遗传距离也是0.004，表明它们的亲缘性最近，在进化树上聚于同一分支，但与青花菜和甘蓝BURP的遗传距离稍远。从青花菜“优秀”中获得的BURP与甘蓝、芜菁和甘蓝型油菜聚于同一组(I)，支持率达100%。同为拟南芥属的拟南芥和玉山筷子芥BURP之间的遗传距离为0.022，它们在进化树上处于同一分枝(II)，支持率达99%。荠属的荠菜与亚麻荠属的亚麻荠BURP在进化树上处于同一组(III)，它们之间的遗传距离为0.105，支持率达100%。而白菜花科醉蝶花的BURP与十字花科植物的同源序列差异较大，遗传距离0.376～0.466，在进化树上单独聚为一组(IV)(图3)。综上所述，青花菜BoBURP2与同属的甘蓝、芜菁和甘蓝型油菜BURP的亲缘关系最近，与同科不同属的拟南芥、玉山筷子芥和荠菜的关系次之，与不同科的醉蝶花亲缘关系最远。

2.4 BoBURP2的表达分析

为明确BoBURP2在盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，以等量的cDNA为模板，采用RT-PCR进行表达分析。结果表明，BoBURP2的表达受2种逆境条件的诱导，但表达模式略有不同。在NaCl胁迫下，BoBURP2的表达量逐渐增加，在24 h时的表达量最大，随后逐渐降低；在干旱胁迫下，基因的表达量逐渐增加，在48 h时达到最大值，在72 h时仍维持较高的表达量(图4)。

3 讨论与结论

植物BURP蛋白以家族形式存在，参与多种生物学过程，并在生长发育和逆境胁迫响应中起重要作用。近年来，已从多种植物中鉴定到BURP，如二穗短柄草Brachypodiumdistachyon、玉米Zeamays、高粱Sorghumbicolor和葡萄Vitisvinifera等[5,14-15]。RD22是BURP基因家族成员之一，最早由Yamaguchi-Shinozaki等[7]利用示差筛选法从经干旱胁迫处理的拟南芥中获得，因其受脱水诱导表达而得名[7]。RD亚家族的成员众多，它们的功能涉及干旱、低温和盐胁迫响应[7,16]。在动物及微生物中尚未发现RD22的同源序列，推测RD22可能是植物特有的一类基因[17]。在细胞脱水时，RD22可与金属离子结合，从而有效降低金属离子对细胞的毒害[18-20]。本研究从青花菜中克隆到1个RD22类BURP基因，该基因的编码区全长为840 bp，编码279个氨基酸，推测的蛋白质序列长度比西伯利亚蓼和柽柳的RD22短[9,11]。青花菜是甘蓝的1个变种，序列比对结果表明，BoBURP2与甘蓝BURP的相似性最高，达99%，仅在个别残基上存在差异，它们在进化树上处于同一分枝，而与同属的芜菁、甘蓝型油菜的序列差异稍大，在进树上处于相邻的分枝，这与芸薹属植物的分类结果完全一致[21]。

正常情况下，RD22在拟南芥中的表达量极低，但经脱水处理后，RD22基因的表达量显著增加，暗示该基因与干旱应答相关[8]。在400 mmol·L-1NaCl和50 μmol·L-1ABA胁迫下，盐穗木HcRD22的表达量在12 h时分别上调2.5和3.0倍[10]。在干旱诱导下，拟南芥AtRD22在叶和根中的表达量显著增加，而在T-DNA突变体中，未检测到该基因的表达[22]。过量表达柽柳BURP成员基因RD22，烟草N.tabacum对盐胁迫的抗性显著增强[11]。而本氏烟草N.benthamiana中过量表达葡萄VvRD22基因，能显著提高抗盐能力[23]。本研究从青花菜叶片中克隆到1个BURP基因，该基因与RD22具有很高的相似性。RT-PCR结果表明，该基因的表达受NaCl和干旱胁迫诱导，推测该基因参与这两种逆境条件的响应，与Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki的研究结果相似[8]。

本研究以青花菜为材料，克隆得到BoBURP2基因，并进行了生物信息学分析和表达分析，为后续基因的功能鉴定和抗逆分子育种奠定了基础，下一步，将开展该基因的功能鉴定。

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(责任编辑：林海清)

Cloning and Expression Analysis on BoBURP2 Gene of Brassica oleracea var. italica

ZHANG Yan-ru, XU Xin, Zhu Qi, ZHOU Xiu-qian,YU Ke-ke, GONG Xiu, JIANG Ming*

(CollegeofLifeSciences,TaizhouUniversity,Jiaojiang，Zhejiang318000,China)

A plant-specific protein, BURP plays an important role in the growth, development, and stress response of a plant. In this study, a BURP gene designated asBoBURP2 was isolated from broccoli,Brassicaoleraceavar.italica, using PCR. The gene sequencing showed its genome DNA was 1 218 bp with a single intron. The complete coding sequence was 840 bp in length, encoding 279 amino acids. It shared a high homology withRD22, which is also a member of the BURP family. Phylogenetic analysis onBoBURP2 showed its sequence to be highly similar to those ofB.oleracea,B.rapa, andB.napus. They could possibly be grouped in a same clade. On the other hand, the low similarity it shared with the sequence ofTarenayahasslerianasuggested a remote relationship between them. The RT-PCR results indicated the expression ofBoBRUP2 was induced by both NaCl and drought stresses, with the highest levels detected at 24 h and 48 h. The cloning and expression analysis onBoBURP2 provided the information for further studies on the identification of its genetic function as well as the molecular breeding for stress resistantB.oleraceavar.italica.

Brassicaoleraceavar.italica;BoBURP2; RD22; cloning; expression

2016-07-10初稿；2016-08-26修改稿

章燕如(1994-)，女，研究方向：植物分子生物学(E-mail：674155045@qq.com)

*通讯作者：蒋明(1973-)，男，副教授，研究方向：植物逆境生物学及其分子调控(E-mail：jiangming1973@139.com)

国家级大学生创新创业训练计划项目(201510350011)；浙江省公益性技术应用研究计划项目(2016C32091)；台州市科技计划项目(162ny14)

Q 78

A

1008-0384(2016)09-933-06

章燕如, 许鑫, 祝琦,等.青花菜BoBURP2基因的克隆与表达分析[J].福建农业学报，2016，31(9)：933-938.

ZHANG Y-R，XU X，ZHU Q，et al.Cloning and Expression Analysis onBoBURP2 Gene ofBrassicaoleraceavar.italica[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(9)：933-938.