陕西卫矛无菌萌发技术的研究

2016-12-04河南红枫种苗股份有限公司郑州450008

种子 2016年10期

，，，， (河南红枫种苗股份有限公司，郑州 450008)

陕西卫矛无菌萌发技术的研究

张家勋，张丹，孟伟芳，王东超，何甜甜
(河南红枫种苗股份有限公司，郑州 450008)

在无菌条件下观察不同激素配比、接种时间、胚乳体积对陕西卫矛种子生长情况的影响，研究种子无菌萌发的诱导因素。结果表明：培养基为MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 时，生长情况最好；接种时间为9月10日、9月30日时，发芽率达95%以上；胚乳远端切除1/4、1/3体积时，出苗顺利；转接到MS无激素培养基中，成活率最高，生长最快。

陕西卫矛；种子；组培；激素；接种时间；胚乳

陕西卫矛(EuonymusschensianusMaxim)又名金丝吊蝴蝶，是卫矛科卫矛属翅果系，果实具翅4～5，成熟后为红色，翅长可达2.5～3 cm，宽1.5～2 cm，吊在绿叶之间，犹如振翅欲飞的蝴蝶，是观赏价值极高的园林树种[1-3]。然而，陕西卫矛种子在自然条件下萌发率极低，经常规播种试验，证明其萌发率几乎为0，而经过一定浓度的赤霉素、细胞分裂素等激素处理之后发芽率依然很低，现在陕西卫矛快繁技术多是以带芽茎段作为外植体[ 4-6]。目前，园林上多采用丝棉木嫁接的方式进行繁殖[7]，虽然可以实现陕西卫矛的规模化繁殖，但嫁接属于无性繁殖，无法实现陕西卫矛的基因重组和品种改良。因此，必须清楚陕西卫矛的萌发机制，实现种苗的高出芽率，只有这样，才能实现陕西卫矛的杂交育种和品种改良的目的。在对温室播种1个月未发芽的陕西卫矛种子进行解剖后发现，一半以上的种子被霉菌侵染腐烂，其余未腐烂的种子既不腐烂也不萌发，直到半年后才开始有少量的种子萌发，发芽率不足千分之一。说明霉菌侵袭和种子休眠是导致陕西卫矛发芽率低的两大原因。因此，针对陕西卫矛种子的表现，拟在添加不同激素配比的培养基中进行无菌播种，一方面杜绝霉菌的侵袭，另一方面观察激素是否能打破陕西卫矛的休眠机制，使其顺利萌发。

表1 激素对种子生长情况的影响

培养基激素(mg/L) 种子生长天数(d) KTNAA10204060MS0．50．1无萌发迹象子叶开始伸长子叶完全长出子叶开始展开，根部开始伸长MS1．00．1子叶开始萌动子叶完全长出并开始展开子叶已经长大并完全展开，真叶开始发育，根开始发育子叶发黄脱落，第1片真叶展开，根已经伸长，并开始长出须根MS1．50．1子叶开始萌动子叶完全长出并展开子叶已经长大但表面皱缩，不正常变厚、发脆根部不发育，呈瘤状突起MS00无萌发迹象无萌发迹象少量子叶稍有伸长子叶仍未完全长出

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用种子采自河南红枫种苗股份有限公司的黄河滩基地，此地的陕西卫矛长势良好、无病虫害。

1.2 方法

采集外观完整、无病虫害的果实带回实验室，先用加有洗涤剂的清水浸泡0.5 h，去除果皮上残留的污渍等，再用流水冲洗2 h后，晾干。用刀片切去果翅及上部的果蒂和下部的脐(注意不要伤到内部的种子)。切好后放入0.1% HClO中浸泡10 min。在超净工作台上依次用75%酒精和0.1% HgCl各消毒5 min。消毒完成后，用无菌水冲洗5～6遍，每次浸泡时间3 min以上。

清洗完成后，在超净工作台上用手术刀和镊子把果实剥开，取出种子，并将种子外面的红色假种皮剥离干净，放入1% H2O2中待用。

1.2.1 激素水平对照试验

将陕西卫矛种子接种于配方分别为MS、MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培养基中，每瓶接3颗种子，每个处理40瓶。根据生长情况选出适合陕西卫矛种子生长的培养基配方，进行以下试验。

1.2.2 接种时间对照试验

试验从2014年8月份开始进行，分别于8月1日、8月21日、9月10日、9月30日、10月20日、11月9日对采收的6批果实进行无菌接种，接种的培养基配方根据1.2.1结果选取，每瓶接3颗种子，每个处理40瓶。

1.2.3 胚乳切除对照试验

将陕西卫矛种子按照不同部位和不同大小对种子进行切除。在种脐的远端位置，分别切除1/5、1/4、1/3、1/2体积的胚乳，在种脐一端，切除1/5体积，切好后进行接种，种脐一端朝下，插入培养基内一半，培养基配方同1.2.2，每瓶接3颗种子，每个处理40瓶。

1.2.4 转接对照试验

根据1.2.1试验结果，选取60 d后生长最佳的培养基配方中的陕西卫矛苗，分别转接到MS、MS+KT 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 4种培养基中，每瓶接种1棵苗，每个处理40瓶。

1.2.5 炼苗

选取生长健壮的瓶苗，先开瓶炼苗2 d，使幼苗适应外界环境后，将苗取出，不要伤到根系，流水冲净植株上附着的培养基，后将苗栽到准备好的已灭菌培养土中，培养土按照蛭石∶泥炭=1∶1的体积比进行配制。移栽后喷洒多菌灵溶液，并覆膜放置阴凉处1个月左右，待新叶、新根长出后放置向阳处培养，注意保持湿度，温度保持在15～25 ℃，逐步加强通风，待1个月之后幼苗长势健壮再进行露天栽植。

2 试验结果

2.1 激素对种子生长情况的影响

如表1，在MS培养基中，陕西卫矛种子培养60 d时，子叶未完全长出；添加KT 0.5 mg/L和NAA 0.1 mg/L时，60 d时根部开始生长；随着KT浓度的上升，当KT 1.0 mg/L时，60 d时真叶展开且开始长出须根；当KT 1.5 mg/L时，60 d时根部出现瘤状突起。可见，MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 的培养基作为接种培养基表现最好，激素浓度过低胚发育缓慢，激素浓度过高则导致幼苗发育不正常，根部不发育。

2.2 接种时间对种子生长状况的影响

由表2可以看出，陕西卫矛种子的最佳接种时间为9月10日、9月30日，此时果实饱满，果皮黄绿色，胚发育完全，10 d后发芽率可达95%以上。8月1日、8月21日接种后，种胚死亡或出苗后表现为白化苗；10月20日、11月9日，此时果实变红后炸开，种子和外界接触，接种后染菌率极高。

经过6个时间点的接种试验发现，后期成熟的种子在果皮裂开与外界接触后，染菌率极高，说明霉菌可能是导致种子播种后失活的主要原因。

表2 接种时间对种子生长状况的影响

接种时间果实、种子发育情况接种后生长状况8月1日果实青色，假种皮未变红，种子幼嫩。生长缓慢，不出苗或者为白化苗。8月21日果实青色，假种皮稍微变红，种子较大但仍较嫩。少数发育成正常苗，其余多为白化苗。9月10日果实青黄色，假种皮红色，种子饱满。发芽很快，10d发芽率可达95%以上。9月30日果实黄色，少数开始变红，种子饱满。发芽很快，10d发芽率95%以上。10月20日果实多为红色，少数开始炸裂，种子饱满，种皮较硬。发芽很快，10d发芽率45%，剩余染菌死亡。11月9日果实鲜红，开始皱缩，多数开始炸裂，种皮极硬。接种10d后，80%染菌死亡。

表3 胚乳对种子萌发情况的影响

胚乳切除体积切面形态种子萌发情况种脐远端切除1/5切面很小，几乎看不到子叶。10d后子叶萌动但未顶出，60d后仍未萌发。种脐远端切除1/4切面较大，可见长约3mm线状的子叶横切面。10d后子叶萌动，顺利萌发。种脐远端切除1/3切面较大，可见长约4mm线状的子叶横切面。10d后子叶萌动，顺利萌发。种脐远端切除1/2切面最大，可见长约4mm线状的子叶横切面。10d后子叶萌动，顺利萌发，后期生长缓慢、瘦弱，最终死亡。种脐一端切除1/5切面很小，几乎看不到子叶。无萌发

表4 转接后激素对种子生长情况的影响

培养基激素(mg/L) 种子生长天数(d) KTNAA10204060MS0．10．1生长良好生长良好根系逐渐生长，叶片逐渐展开，部分叶片出现皱缩。部分幼苗生长良好，部分死亡。MS0．50．1生长良好生长逐渐停滞，不再发出新根，根尖出现发黑现象。根系基本全部死亡。MS1．00．1生长良好生长停滞，根尖发黑，出现根毛死亡。根部肿胀，脱分化形成愈伤组织，失去吸收功能，最终整株死亡。MS00生长良好生长良好生长良好根系发达茎干粗壮，叶片发育正常，可以进入炼苗阶段。

2.3 胚乳对种子萌发情况的影响

在种脐的远端位置，切除1/5体积，未萌发；切除1/4、1/3，出苗顺利；切除1/2，顺利萌发，后生长缓慢、瘦弱，最终死亡，可能是由于胚乳切除过多造成；种脐一端，切除1/5，无萌发，可能伤到胚芽生长点，种子已失去活性。

2.4 转接后激素对种子生长情况的影响

无激素培养基前40 d生长较慢，40 d后进入生长旺盛期，成苗率在95%以上。幼苗死亡率随激素浓度升高而升高，可能是因为幼苗内源性激素水平较高，已经不需要外源性激素进行调节。因此，在无菌苗长出后转入无激素培养基中培养最好，成活率最高，生长最快。

3 结论分析

有研究表明，陕西卫矛种子萌发是多因素共同作用的结果[8]。无菌条件、接种时间、切除胚乳的体积和激素刺激是必不可少的。

从结果来看，接种时间不同，主要是种子的发育情况不同对后期生长的影响[9]，在9月10日、9月30日接种时，种胚发育完整，又未与外界接触，此时是最佳接种时间。切除部分胚乳后可以促进种子萌发，可能有两方面的原因，一是破除了坚硬种皮的包裹，二是胚乳作为储存养分的“源”，当其收到损伤刺激时，养分向作为“库”的子叶流动，促进了下一步各器官的发育，这在张荣萍[10]对小麦的研究中有提到，所以当切除陕西卫矛种子1/4、1/3体积胚乳时，出苗顺利。此外，适当的外源激素可加速这一过程，在NAA 0.1 mg/L浓度一定的情况下，KT浓度是1 mg/L，种子发育最好。但是当子叶完成形态建成，各部分发育完全，能够自主进行光合作用时，内源性激素水平开始升高，此时的外源性激素就显得多余，并会对幼苗造成毒害，因此，在幼苗发育完成时必须将其转入无激素培养基中。

[1]胡丽娟,郭军战,王文君,等.陕西卫矛的组织培养及植株再生[J].植物生理学通讯,2010,46(2):153-154.

[2]刘亚芬,郭甲科.“蝴蝶树”陕西卫矛[J].中国花卉园艺,2010(4):37.

[3]尚爱芹,孙振元,赵梁军.爬行卫矛下胚轴高频离体再生体系的建立(英文)[J].林业科学,2009,45(2):136-141,175.

[4]袁云香.陕西卫矛愈伤组织诱导的初步研究[J].北方园艺,2011(23):119-120.

[5]袁云香.陕西卫矛再生植株生根的影响研究[J].科学技术与工程,2012,12(27):7 048-7 050.

[6]袁云香,勾雪娇,冯辽辽,等.陕西卫矛组织培养再生体系的建立[J].贵州农业科学,2012,40(4):17-19.

[7]王军涛,郭建喜,查振道,等.陕西卫矛夏季嫁接试验[J].陕西林业科技,2008(3):35-36.

[8]袁云香.陕西卫矛组织培养的影响因素探析[J].湖北农业科学,2012,51(6):1 265-1 267.

[9]吴琰,郭宝林,鲁韧强,等.卫矛属植物组织培养无菌苗的方法研究[J].河北林果研究,2007,22(2):140-142.

[10]张荣萍,王长发,张嵩午,等.小麦胚乳充实特性研究初报[J].麦类作物学报,2002,22(4):54-57.

(本栏目责任编辑：申晓)

Study on Aseptic Germination Technique ofEuonymusschensianus