美国黑莓组织培养一次成苗研究

2016-12-04贵州省植物园贵阳550004

种子 2016年10期

，，， (贵州省植物园，贵阳 550004)

美国黑莓组织培养一次成苗研究

文光琴，张群英，廖优江，聂飞
(贵州省植物园，贵阳 550004)

以美国黑莓纳瓦好(Navaho)带芽茎段为外植体，研究一次成苗的最佳程序。结果表明，在不添加生长调节剂的MS培养基上，初代培养可使外植体萌发、伸长(生长)形成嫩枝，将嫩枝剪成带1～2枚叶片的茎段(以下简称插条)，再扦插到MS培养基上，如此多次继代后，在MS培养基上会有部分生根，将生根的完整植株移栽。未生根的无根苗如上述再扦插到MS培养基上，完成一次成苗。也可以把一部份插条扦插到1/2 MS+6-BA 0.01 mg/L+IBA 0.3 mg/L的生根培养基上同时完成继代、伸长，生根，生根率可达100%，另一部份出瓶移栽，也可将无根嫩茎用IBA 0.1%快浸处理后扦插在苔藓中，生根率达90%以上。将生根植株移栽到森林腐植土上，成苗率达100%。

黑莓；短枝扦插；一次成苗

美国黑莓纳瓦好(Navaho)属蔷薇科(Rosaceae)悬构子属(Rubus)多年生的落叶灌木果树，黑莓果实为聚合浆果，富含多种维生素和矿物质，在医药、保健、化妆品等方面有特殊用途，1993年被联合国粮农组织(FAO)称为“第三代新兴水果”[1]。黑莓纳瓦好生长快、分枝多，管理粗放，既可作庭园绿化树种，又可广泛用于沙荒地改造，具有很高的生态效益[2]。1994年江苏省中国科学院植物研究所首次从美国农业部柯互利斯种质保存中心引进纳瓦好，2000年，贵州省麻江县引种栽培成功，2006年江苏省农林厅组织的专家鉴定，美国黑莓纳瓦好果实酸甜爽口，鲜食加工皆宜，耐旱，耐-15 ℃低温，能安全越冬，适宜栽培地域广泛。目前，黑莓纳瓦好的繁殖主要还是以扦插繁殖为主，有关黑莓组织培养报道甚少[3-10]，一次成苗更是未见报道。本试验主要研究如何缩短纳瓦好培育时间、增加繁殖系数、提高生根率、移栽成苗率，以达到既降低育苗成本，又能一次成苗的目的，旨在为纳瓦好新品种种源快速繁殖，实现工厂育苗提供可靠的技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

外植体选用贵州省麻江县黑莓种植基地中1年生黑莓纳瓦好长势好、基本一致的枝条，剪去枝条上叶片和叶柄，留下中部茎段，在洗涤剂中浸泡10 min，并用软毛刷清洗茎干在流水中冲洗20 min，枝条剪成长2 cm左右带1～2腋芽。

表1 不同消毒剂对外植体发芽效果的影响

消毒剂类型接种数(个)灭菌时间发芽数(个)污染数(个)灼伤数(个)发芽率(%)75%乙醇301min30075%乙醇3010s226260．1%HgCl23010min1947630．1%HgCl2305min20646675%乙醇，3010s234376及0．1%HgCl25min

注：发芽率(%)=发芽数÷接种数×100%。

表2 不同光照强度对出芽及褐化的影响

光强度(lx)培养时间抽梢时间出芽数(个)出芽率(%)生长情况褐化暗培养7d转入1500lx培养1528100芽绿色☆1007d转入1500lx培养2025芽绿色☆1500302520浅绿色☆☆2000302513淡浅绿色☆☆☆300030308淡浅绿色☆☆☆

注：☆褐化较轻；☆☆褐化重；☆☆☆褐化极严重。

1.2 试验方法

1.2.1 组培室培养

1) 培养条件控制：培养室温度(25±1)℃，湿度70%左右，常规管理，光照14 h/d，光照强度1 500～2 000 lx。

2) 培养基配制：基本培养基为MS附加不同浓度生长调节剂6-BA、IBA，蔗糖浓度30%(生根培养基蔗糖浓度20%)，琼脂6%，pH值为5.8。

3) 培养用三角瓶的选择：初代培养用50 mL三角瓶装培养基250 mL，每处理10瓶，每瓶1株，3个重复，继代、生根培养用200 mL罐头瓶，每瓶2个茎段，每处理3次重复。

4) 培养前的消毒与灭菌：用4种消毒剂对外植体茎段进行消毒，最后用无菌水冲洗6次，滤纸吸干表面水份，15 d后观察生长情况。

5) 茎段在不同光照条件下的培养：将消毒灭菌后的茎段在无菌条件下植入培养基中，分别进行暗培养(7 d后移至1 500 lx)、100 lx光照培养(7 d后移至1 500 lx)、1 500 lx光照培养、2 000 lx光照培养、3 000 lx光照培养，光照时间14 h/d，培养30 d后观察发芽数，褐变情况。

6) 无菌苗在不同培养基中的培养：将无菌苗剪成带1～2枚叶片的茎段，接种在5种不同生长调节剂配比的培养基上，每个处理10个样品，3次重复，45 d后观察生长情况。

1.2.2移栽驯化

1) 基质消毒：在塑料大棚内，将过筛1 cm的森林腐殖土、田园土、蛭石按一定比例混合，待pH值调至5.8左右装入塑料容器杯内，放在准备好的苗床上。配50%多菌灵1 000倍液，用洒水壶均匀浇灌在苗床上，然后用塑料膜立即扣上小拱棚，消毒24 h，揭开塑料膜敞气24 h，每个处理10～15杯，3次重复。

2) 苔藓消毒：将苔藓浸泡在50%多菌灵1 000倍液中10 h，捞出后稍沥干水(用手捏挤不出水为准)铺在苗床上压平压实，厚度10 cm，也可上容器杯备用。

3) 有根组培苗移栽：将生根组培苗从瓶中取出，在50%多菌灵1 000倍液中洗净附着在根部的琼脂，然后单株移栽到消过毒的4种基质容器中，浇足定根水立即扣上塑料膜小拱棚，并盖上遮阴网，以后每隔7 d浇1次KH2PO4300倍液，30 d后揭膜，50 d后揭开遮阳网观察生长情况。

4) 无根组培苗移栽：将4～5 cm高的无根组培苗在50%多菌灵1 000倍液中洗净琼脂用0.1%IBA溶液快浸30 s后插入苔藓或河沙中，扣上小拱棚，并盖上遮阳网，45 d后观察生长情况。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂对外植体发芽的影响

表1结果表明，用75%乙醇先灭菌10 s，再用0.1%HgCl2灭菌5 min，发芽个数达到23个，发芽率为76%，污染数为4个，灼伤数为3个，此方法效果最好。

2.2不同光照强度对出芽及褐变的影响

从表2可看出，暗培养和弱光培养7 d后转入1 500 lx光培养抽芽颜色绿色，在组培中光的作用并不是提供光合作用的能源，因为培养基中已有足够的碳源利用，这时细胞是处在瓶养的条件下，因此，光对器官的作用是一种诱导反应，器官发生开始1周不需要光，反而有光培养的诱导受到抵制，但是当芽萌动，开始抽梢0.5 cm时又得移到1 500 lx光照下培养，芽抽梢更快，25 d后芽伸长[2]，所以芽在黑暗和弱光下培养可降低多酚的养化速度[12]。

2.3 不同生长调节剂配比对成苗时间的影响

由表3可看出，1#初代培养时间较长，大部分生根要70 d左右，随着代数增加培养时间缩短，大部分生根只需50 d左右，生根率58.6%，没有生根的剪成带2枚叶片的茎段再接种到MS培养基上，50 d左右又可扦插或生根。1个芽1年增殖625株，可增殖4～5代。2#、3#、4#诱导出的丛生芽，但茎细弱，叶片小，直接用于生根和移栽，生根率和移栽成苗率会下降，因此在增殖和生根之间，还需要一个壮苗培养的过程，使叶片变大，茎杆粗壮，因此成苗时间需要120～140 d，以4#为例，全年只能完成3代培养，1年1个芽增殖216～256株。5#、6#、7#将无菌生根植株一部分剪成1～2枚叶的茎段，扦插在原生根培养基上继代，一部分从瓶中取出移栽到基质中，由于茎杆粗壮，叶片大，在瓶内生根率达100%，能在同一培养基上完成扦插、伸长，移栽。所需时间50 d左右，以6#为例，组培苗生长整齐，根系发达，1个芽1年完成6～7代，增殖729株。总的对比初代培养应以1#培养基为好，多代繁殖后1次成苗培养基应以6#为佳。

表3 不同生长调节剂配比对成苗时间的影响

编号培养基增殖方式有效增殖数苗高(cm)成苗所需时间(d)继代壮苗培育生根全年完成代数1#Mg/LMS+0扦插丛生5．215．745～5040～454～52#MS+6⁃BA1+NAA0．1丛生芽4．133．245～5040～4540～453～43#MS+6⁃BA2+NAA0．1丛生芽3．823．145～5040～4540～453～44#MS+6⁃BA1+NAA0．1+GA3丛生芽6．214．445～5040～4540～453～45#1/2MS+IBA0．1+6⁃BA0．01扦插4．895．550～555～66#1/2MS+IBA0．3+6⁃BA0．01扦插5．375．945～506～77#1/2MS+IBA0．5+6⁃BA0．01扦插4．285．150～555～6

注：有效增殖数，能形成单芽，易抽梢展时的芽体；增殖方式：丛生芽，芽分化为丛生状，扦插，将无菌嫩芽剪成带1～2叶的茎段扦插，苗成单株或多株向上直立生长，叶片大，茎杆粗。

表4 不同基质对组培苗生长的影响

基质移栽数成苗数(个)成苗率(%)苗高(cm)侧须根数(根)生长情况森林腐殖土505010015．36．12叶片大，茎粗，已抽梢田园土302066．712．13．72叶片一般，茎粗蛭石302893．310．55．22叶片一般，茎细，已抽梢苔藓303686．76．55．38叶片较小，茎细

2.4 不同基质对组培苗生长的影响

由表4可知，森林腐殖土疏松肥沃、透气性好，pH值适合，生长快，发根多。田园土土壤较板结，透气性较差，浇水多时易烂根，但土壤较肥沃。蛭石透水，保水性好，病虫害少，但肥力较差，只有靠人工追肥。苔藓未腐烂前，透水，保水较好，但养分低，苗木生长势差。综合以上因子认为，基质对黑莓生长排列为：森林腐殖土gt;蛭石gt;田园土。蛭石和苔藓加强养分管理，苗木质量会有所提高。