蛋白酶制剂对发酵牛肉酱风味物质的影响

王艳玲，周盼盼，李楠楠，韩丽荣，王春玲*

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

蛋白酶制剂对发酵牛肉酱风味物质的影响

王艳玲，周盼盼，李楠楠，韩丽荣，王春玲*

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

以复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶分别酶解牛肉，得到牛肉酶解液，将4种牛肉酶解液分别和大曲混合后兑盐水发酵，比较不同蛋白酶制剂对发酵牛肉酱风味物质的影响。结果表明，添加复合蛋白酶组的总酸、氨基酸态氮和总氮含量分别为1.67 g/100 g、1.11 g/100 g和1.53 g/100 g，优于其他3种酶制剂组。添加复合蛋白酶和风味蛋白酶组的牛肉酱基质检出有机酸7种，提高了丙酸、酒石酸、苹果酸和琥珀酸的含量。在风味物质种类及含量方面，添加复合蛋白酶组检出67种，在酯类、醇类及酸类的种类和含量上比添加其他酶制剂组略有优势。

蛋白酶制剂；牛肉酶解液；发酵牛肉酱；风味物质

我国牛肉酱种类繁多，有传统牛肉酱[1]，也有复合型牛肉酱[2-3]。但是调配型牛肉酱的口味不够醇厚，未经完全水解的牛肉蛋白不能被人体充分吸收。发酵型牛肉酱使用的菌种是米曲霉3.042，其具有分解原料能力强、生长繁殖速度快、孢子产量大、不产生毒素等特点[4]，但不能充分利用动物蛋白生成易于人体吸收的氨基酸和小分子肽类，形成的风味物质也受到限制。蛋白酶制剂是纯度相对较高的蛋白酶生化制品，广泛用于制备氨基酸或多肽。蛋白质酶解是指在酶的作用下蛋白质水解成多肽以及氨基酸的一系列过程，蛋白酶酶解蛋白质能有效改造蛋白质的三维结构，酶解产物是肽链型酶解产物，与原始蛋白的氨基酸组成相比较，其物理化学性质和活性是独一无二的[5-8]。原始蛋白的性质和水解过程的条件决定了酶解产物独有的特性[9]。

因此，本实验以不同的蛋白酶制剂对牛肉蛋白进行酶解，然后进行米曲霉发酵，比较不同蛋白酶制剂对牛肉酱风味物质的影响。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

豆粕、炒小麦、麸皮、香菇粉、面粉、生牛肉等：市售；米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042：天津科技大学菌种保藏中心；复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶：天津春发香精香料有限公司。

氢氧化钠：天津鹏坤化工有限公司；甲醛：天津市北方天医化学试剂厂；硫酸铜、硫酸钾、无水碳酸钠、磷酸二氢钾（均为分析纯）：天津金汇太亚化学试剂有限公司；浓硫酸、磷酸、盐酸（均为分析纯）：淄博建龙化工有限公司；甲基橙：天津市南开化工厂；甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸、甲醇（均为色谱纯）：天津市科密欧化学试剂开发中心。

1.2仪器与设备

DHG-9203B干燥箱：上海市实验仪器厂；95-1磁力搅拌器：上海司乐仪器厂；LRH-250-A生化培养箱：广东省医疗器械厂；LC-10ATvp高效液相色谱分析仪、GC-2000气相色谱分析仪：日本岛津公司；SKD-100凯氏自动定氮仪：上海新嘉电子有限公司；HZF-A100分析天平：上海天平仪器厂。

1.3方法

1.3.1种曲的制备

从米曲汁斜面培养基上挑取3～4环米曲霉3.042孢子，接种至冷却至30℃左右的三角瓶种曲培养基中，当整体培养约40 h左右，观察种曲表面整体全部变为黄绿色，于60℃的条件下干燥约4 h后装入牛皮纸袋中备用。

1.3.2大曲的制备

将原料按质量比豆粕∶炒小麦∶小麦粉∶香菇粉=3∶1∶1∶1混合均匀，拌入原料总质量的30%的水，121℃灭菌15～20 min后接入为原料质量3‰的种曲，于30℃生化培养箱中培养40 h后，待曲料变为均匀的黄绿色，说明曲料成熟。

1.3.3牛肉酱的制作

将制好的大曲与酶解后的牛肉按照质量比4∶3混合，将14°Bx的盐水（40℃）与整体原料按照1∶0.8的质量比混合后装入发酵罐，于42℃生化培养箱发酵10 d后，将生化培养箱温度调至32℃继续发酵20 d。

1.3.4牛肉的酶解

将牛肉打碎后与水按质量比1∶1混匀，根据表1给出的条件以复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶分别对牛肉进行酶解，酶解过程中进行恒温搅拌操作，各样品均水解3 h。其中复合蛋白酶是杆菌蛋白酶复合体，主酶是碱性蛋白酶，酶活力根据主酶活力定义。

表1　四种蛋白酶酶解的条件Table 1　Enzymatic hydrolysis conditions of four kinds of protease

1.3.5测定方法

总酸、氨基酸态氮含量测定：按照国标GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》；总氮含量测定：按照凯氏定氮法；有机酸含量、挥发性风味物质测定：按照参考文献[10]的方法进行测定。

2　结果与分析

2.1总酸含量的跟踪测定

在发酵过程中影响酱制品总酸含量变化最主要的原因是蛋白质经蛋白酶水解后生成含有羰基的多肽和氨基酸。发酵过程中总酸含量的变化趋势见图1。

图1　不同酶制剂对酱醪的总酸含量的影响Fig.1　Effect of different enzymes on total acid contents in the paste sauce

由图1可以看出，不同酶制剂的牛肉酱制品中总酸含量在发酵前期上升速率较快，之后趋于平缓，终端含量相差不大，其中添加复合蛋白酶组总酸含量最高，为1.67 g/100 g。

2.2氨基酸态氮含量的跟踪测定

以氨基酸态氮的含量值来检验氨基酸的含量，氨基酸态氮含量越低，牛肉酱质量越差[11]。氨基酸是酱制品形成多种风味不可缺少的成分，如谷氨酸构成了酱制品的鲜味，其他氨基酸则具有相应的甜味、苦味、酸味等[12]。发酵过程中氨基酸态氮含量变化见图2。

图2　不同酶制剂对酱醪的氨基态氮含量的影响Fig.2　Effect of different enzymes on amino nitrogen contents in the paste sauce

由图2可以看出，空白组、添加酶制剂组均在发酵前10 d增幅较大，而后趋于稳定，在第21天时，氨基酸态氮含量下降，可能是由于氨基酸态氮被酱中其他微生物（如酵母、乳酸菌等）利用。添加酶制剂组的氨基酸态氮含量较空白组略高。其中，添加复合蛋白酶组的氨基酸态氮含量明显高于其他发酵组，发酵终端含量为1.11 g/100 g。由此可见，复合蛋白酶发挥的作用较大，在此指标上，比较适合牛肉酱基质的发酵。

2.3总氮含量的跟踪测定

在蛋白酶和多肽酶的分解作用下，总氮的含量会随着发酵时间的增加而增加，但由于发酵后期微生物的生长消耗部分氮源，而且产生的氨基酸会和某些还原糖发生美拉德反应等，总氮含量在发酵过程中出现一定变化。发酵过程中总氮含量变化见图3。

图3　不同酶制剂对酱醪总氮含量的影响Fig.3　Effect of different enzymes on total nitrogen contents in the paste sauce

由图3可以看出，5个发酵组的总氮含量均在发酵初期的3 d内增长速度较快，这说明原料自身的氮源被逐步利用随后增长速率变缓，稳定后添加酶制剂组别的总氮含量比空白组高，说明添加酶制剂能明显提高酱醪中总氮含量。其中添加复合蛋白酶发酵组的总氮含量最高，达到1.53 g/100 g。

2.4有机酸含量的测定

有机酸对酱制品呈香、呈味有较大的促进效果。如乙酸对酱制品的香气作出了较大的贡献，能显著改善酱制品的口感和风味[13]。有机酸本身具有滋味，同时是形成酯香味的基础[14]。10种有机酸混合标准溶液液相色谱图见图4。

图4　10种有机酸的混合标准溶液液相图谱Fig.4　Chromatograms of mixed standard solution of ten organic acids

由表2可以看出，空白组、添加复合蛋白酶组和添加风味蛋白酶组均检出7种有机酸，添加木瓜蛋白酶、胰蛋白酶组均检测出6种有机酸。除了胰蛋白酶增加了基质中草酸含量之外，其他4种酶制剂均减少了草酸含量。草酸是对人体有害的有机酸，过量的草酸会导致人体酸碱失衡。苹果酸和琥珀酸是重要的食品添加剂，添加4种蛋白酶制剂组均增加了这两种有机酸的含量，增强了牛肉酱的风味。

表2　五个发酵组中有机酸含量的比较Table 2　Content of organic acids in five fermentation groups

2.5挥发性风味物质的测定

风味是衡量食品质量的重要指标之一，研究酱制品中风味物质对酱的工艺改善和品质调控非常必要[15]。微生物释放出来的复杂酶系或添加的酶制剂分解原料中的蛋白质生成多肽、氨基酸风味前体物，这些物质在发酵过程中再经过复杂的反应，形成一些风味物质[16-17]。AISHIMA T等[18]对酱油中的挥发性风味物质进行检测，就是用气相色谱检测的方法，迄今为止，利用气相色谱法检测出的风味物质种类已经达到300多种；王春玲等[19]利用气相色谱-质谱联用法分析耐盐酱油中酵母所产香气成分的种类和含量，并对其酵过程中主要香气成分的动态变化进行研究。WANAKCHAHORNKRA P等[17]研究了顶空萃取、直接溶剂萃取和真空同时蒸汽-溶剂萃取对泰式酱油风味物质分析鉴定结果的影响；LEE S M等[20]对利用固相微萃取气质联用法测定发酵酱油和酸水解酱油风味物质，并对二者进行了对比研究。利用气-质联用法对不同酶制剂的牛肉酱制品中风叶物质进行测定，结果见表3。

表3　五个发酵组检测到的挥发性风味物质分析Table 3　Analysis of flavor substance in the five fermentation groups

由表3可知，空白组共检出挥发性风味物质57种，添加木瓜蛋白酶组共检测出挥发性风味物质59种，添加胰蛋白酶组共检测出挥发性风味物质57种，添加风味蛋白酶组共检测出挥发性风味物质53种，添加复合蛋白酶组共检测出挥发性风味物质67种。其中检出酯类物质种类最多的是添加复合蛋白酶组，且添加酶制剂组较空白组多检出了乙酸乙酯，其是食品中重要的增香物质；醇类是食品中助香物的主要来源，同时是构成酯类物质的前提。含有醇类物质最多的是添加复合蛋白酶组，多检出了1-辛烯-3-醇和3,7-二甲基-7-辛烯醇，并使得Z-3-壬烯-1-醇的含量明显升高。其中1-辛烯-3-醇具有玫瑰和干草香气。3,7-二甲基-7-辛烯醇呈类似玫瑰的浓郁香气，有甜味；醛类在发酵制品中主要来自微生物的转化和氨基酸的分解。在5个发酵组中都检测到了苯乙醛，苯乙醛具有类似风信子的香气，稀释后具有水果的甜香气，在添加复合蛋白酶组中含量较空白组增加，而其他发酵组较空白组含量减少；对风味贡献较大的酚类物质是4-甲氧基苯酚，它具有焦饴糖和酚的气味，能增强发酵制品的酱香味道，其中添加复合蛋白酶组含量最高。

3　结论

酶制剂的添加在一定程度上影响了发酵牛肉酱基质的风味物质组成，添加复合蛋白酶组在醇类、酯类及醛类的种类和含量上比其他添加酶制剂组略好，因而对风味的影响更明显，原因可能是复合蛋白酶的主酶碱性蛋白酶与许多其他内切蛋白酶不同，更适用于动物蛋白的水解，即使在低水解度的情况下也能产出没有苦味的蛋白水解液，因此对牛肉中蛋白质的降解更充分，使得游离氨基酸和挥发性风味成分的含量更多，对风味形成有更加积极的影响。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，属于巯基蛋白酶，具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点[21]。胰蛋白酶是从牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用。风味蛋白酶是利用米曲霉发酵提取而来，可以用来去除低水解度产物的苦肽链，将其彻底降解为氨基酸。添加复合蛋白酶组的总酸、氨基酸态氮和总氮含量分别为1.67 g/100g、1.11 g/100g和1.53 g/100g，优于其他3种酶制剂组。添加复合蛋白酶和风味蛋白酶组的牛肉酱基质检出有机酸7种，提高了丙酸、酒石酸、苹果酸和琥珀酸的含量。在风味物质种类及含量方面，添加复合蛋白酶组检出67种，在酯类、醇类及酸类的种类和含量上比添加其他酶制剂组略有优势。因此，选择添加复合蛋白酶来增强发酵牛肉酱的风味。参考文献：

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Effect of protease on the flavor substances of fermented beef paste

WANG Yanling,ZHOU Panpan,LI Nannan,HAN Lirong,WANG Chunling*
(College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Using protamex,papain,trypsin and flavourzyme respectively to hydrolysis beef,four kinds of beef hydrolysis was obtained,the four kinds of beef hydrolysis were fermented with brine after mixed withDaqu.The effect of protease on flavor substance of fermented beef paste was compared.The results showed that protamex was superior to other types of proteases,and the content of total nitrogen,total acids,and amino nitrogen in the paste was 1.67 g/100 g,1.11 g/100 g,1.53 g/100 g,respectively.Seven kinds of organic acids were detected in the group with protamex or flavourzyme addition,the content of propionic acid,tartaric acid,malic acid and succinic acid were improved.In the type and content of flavor substance,67 kinds of flavor substance were detected in the group with protamex addition,which was slightly better than the groups with other enzyme addition in the type and content of alcohols,acids and aldehyde.

protease;beef enzymolysis;fermented beef paste;flavor substance

TS264.2

0254-5071（2016）10-0027-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.007

2016-05-10

十二五国家科技计划（2013AA102106）

王艳玲（1991-），女，硕士研究生，研究方向为发酵食品。

王春玲（1977-），女，教授，博士，研究方向为功能性食品、酿造食品的研究与开发。