一株抗木霉菌解淀粉芽孢杆菌的筛选与鉴定

努尔孜亚，管建华，贾培松，魏鹏，罗影，贾文捷，郝敬吉吉，3

(1. 农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室/新疆农业科学院植物保护研究所，乌鲁木齐 830091；2. 青河县农业技术推广站，新疆青河 836200；3. 中国农业大学生物学院，北京 100193)



一株抗木霉菌解淀粉芽孢杆菌的筛选与鉴定

努尔孜亚1，管建华2，贾培松1，魏鹏1，罗影1，贾文捷1，郝敬吉吉1，3

(1. 农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室/新疆农业科学院植物保护研究所，乌鲁木齐 830091；2. 青河县农业技术推广站，新疆青河 836200；3. 中国农业大学生物学院，北京 100193)

【目的】将一株从阜康市食用菌栽培基地棉籽壳发酵料中的分离得到的芽孢杆菌FKB-1，依据形态学与16S rDNA序列比对明确其分类地位。【方法】采用对峙平板法进行初筛、复筛，然后利用抑菌圈法测定抑菌效果，并镜检菌丝生长情况。通过形态学观察，生理生化及16S rDNA 基因序列对比分析研究其分类地位。【结果】生防细菌FKB-1对绿色木霉菌具有稳定的抑菌效果，抑菌直径率达57%；同时16S rDNA序列比对结果显示其为解淀粉芽孢杆菌。【结论】FKB-1是一株抗木霉菌的生防解淀粉芽孢杆菌。

解淀粉芽孢杆菌；绿色木霉菌；抑菌作用；生理生化

0 引 言

【研究意义】 蘑菇绿霉病又称木霉病，可对阿魏蘑菇、双孢蘑菇等多种食用菌菌丝与子实体造成危害，木霉是一类普遍存在的真菌，常见于土壤中，是土壤微生物的重要群落，也见于植物残体及动物粪便上，从植物根围，叶围及种子、球茎表面经常可以分离到[1-3]。【前人研究进展】木霉可侵染阿魏蘑菇、双孢蘑菇、香菇、银耳、杏鲍菇、毛木耳、灵芝等多种食用菌，各种食用菌的菌种、菌筒、栽培料和子实体上均可发病，如阿魏菇受害后菌柄和菌盖背面变褐腐烂，病部产生绿色霉层；食用菌早期染病的子实体萎缩不长，后期感染的子实体逐渐腐烂，产量损失巨大[4]。常见的病原菌是绿色木霉菌(TrichodermaviridePers.)。广泛存在于阿魏蘑菇等食用菌生产各个环节，是食用菌生产和袋料栽培的一种重要的竞争性病害。其分解纤维素能力强，不仅与阿魏菇等蘑菇争夺营养，而且还分泌毒素影响蘑菇菌丝的定植及子实体的形成。分生孢子通过气流、水滴、昆虫等传播扩散，高温高湿有利该病害的发生[5]。防治绿霉病传统的主要方法是培养料中拌入化学药剂。但是这种方法不仅带来环境污染，同时也威胁着人类健康。随着化学农药的使用，病原菌抗药性不断增加，使防效降低。近年来。生物农药具有成本低，无污染，无残留，不产生抗药性等与传统的化学农药相比较的优点[6]，被广大生产者认同。【本研究切入点】目前关于生防菌株的研究主要是生防细菌包括芽孢杆菌、土壤放射杆菌、假单孢杆菌等。芽孢杆菌属中的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)抑菌广谱性强，对炭疽病(Anthracnose.spp )[7]、青霉病(Penicilliumitalicum)[8]、柑桔青霉菌(Penicilliumdigitatum)[9]等都有抑制作用，因此在生物防治中有广阔的应用前景。【拟解决的关键问题】研究室从阿魏蘑菇培养料中采用抑菌实验法筛选鉴定出一株解淀粉芽孢杆菌。利用对峙平板法，菌丝镜检等证明其抑菌效果。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

FKB-1筛选自阜康市鱼儿沟3队阿魏蘑菇栽培基地棉籽壳发酵料中。

木霉病菌株(T.viride),由新疆农业科学院植物保护研究所提供。

1.1.2 供试培养基

LB培养基(固体)：胰化蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，水1 000 mL ，pH 7.0。

PDA培养基(固体)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉16 g，水1 000 mL，pH自然。

1.2 方 法

1.2.1 菌株初筛

将1 g棉籽壳加入100 mL 蒸馏水中，制备悬浊液，分别稀释获得浓度为10-6，10-7，10-8(W/V)的样品溶液，分别移取0.1 mL 涂布于固体初筛培养基平板上，30℃培养24 h。

1.2.2 菌株复筛

以对峙平板法复筛[10]，从上述初筛平板上挑取形态不同的菌落在木霉病菌琼脂块的一侧划线，以不划线的作为对照组，培养4 d , 测其抑菌率。

抑菌率(%)=[(对照组木霉菌直径-处理木霉菌直径)/对照组木霉菌直径]×100%。

1.2.3 形态学特性

将有抑菌效果的菌株接种于固体初筛培养基平板中，27℃培养，观察单菌落的形状、大小、颜色等形态特征。采用革兰氏染色法，观察菌体形状、革兰氏染色反应。

1.2.4 生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》等相关内容[11-13]，菌株对应生理生化进行验证。测定项目包括：革兰氏染色，生长温度测定，甲基红，淀粉水解，明胶液化，厌氧性测定，葡萄糖、甘露醇产酸，V-P测定，过氧化氢酶，氧化酶, 菌落颜色等。

1.2.5 菌株的分子生物学鉴定

采用酚氯仿抽提法提取菌株的DNA。以16S rDNA 引物进行PCR 扩增。Forward primer P1(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)；Reverse primerP2(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。扩增反应体系25 uL反应体系：10×PCR buffer 2.0 uL，MgCl22 mmol/L,dNTPs 400 mmol/L,ITS4,ITS5为0.8 umol,模版DNA 50 ng，TaqDNA聚合酶1U。PCR反应条件：105℃预热，94℃ 5 min；94℃ 30s,55℃ 30s，72℃ 1 min,35个循环；72℃ 10 min, 扩增产物于4℃保存。检测后送北京鼎国公司测序。PCR 产物测序，与NCBI 进行BLAST 比对[9]，并以MEGA6软件进行系统发育树的构建。

拮抗菌FKB-1的鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[14]、《伯杰细菌鉴定手册》[15]及《分子克隆实验指南》[16]的方法对拮抗菌F1 的菌体形态、生理生化指标进行测定及16S rDNA 测序。

2 结果与分析

2.1 菌落形态

在营养琼脂板上菌落为圆形，乳白色，表面初始光泽，几天后变为褶皱，边缘翘起。平板中可获得直径为5 mm 的菌落，如图1(A)。通过革兰氏染色验证为革兰氏阳性，菌体呈现椭圆形，两端紫色，中间较透明，如图1(B)(10×100oil)。图1

图1 FKB-1菌落形态及菌体革兰氏染色

2.2 抑菌效果验证

2.2.1 抑菌效果的平板验证

通过对峙平板法检验FKB-1的抑菌效果，其抑菌率为57%。图2

图2 FKB-1对木霉菌的抑菌效果

2.2.2 抑菌效果的镜检

研究表明，正常菌丝(B)粗壮，孢子浓密，有明显的孢子束。受抑制的菌丝(A)出现弯曲、褶皱、断裂、畸形等现象，且没有孢子囊和孢子束。因细胞膜通透性的增加，细胞质基质外流，使菌丝明显变细，并影响染色效果。图3

2.3 菌株鉴定

2.3.1 生理生化结果

FKB-1的部分生理生化特征表现为，菌株不能厌氧生长，生长温度范围5～50℃，最适生长温度30～37℃。甲基红反应阴性，V-P反应阴性。能分解葡萄糖、甘露醇、水解淀粉、明胶等。过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性，革兰氏染色呈阳性，菌落乳白色。表1

图3 FKB-1对木霉菌菌丝作用显微形态(10×40)

2.3.2 FKB-1菌株的16S rDNA鉴定

FKB-1菌株经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下显示的图像。测序结果表明，扩增的16S rDNA序列全长1 190 bp。将序列提交GenBank经与GenBank中相关基因序列进行同源性比对，菌株FKB-1与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的DNA 重合率100%同源性达到99%。通过系统发育分析，供试菌16S rDNA与解淀粉芽孢杆菌亲缘最近。鉴定结果为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacien)。表1，图3～5

图4 FKB-1菌株的16S rDNA PCR扩增电泳结果

特征CharacteristicsFKB-1特征CharacteristicsFKB-1厌氧生长Anaerobiccondition-生长温度/℃Growthtemperature5～50℃-甲基红M．Rreaction-V-P反应V-Preaction-葡萄糖产酸Acidroductionfromglucose+甘露醇产酸AcidproductionfromMannito+淀粉水解Starchhydrolysis+明胶液化试验Glutinhydrolysis+过氧化氢酶Peroxidase+氧化酶Oxidase-革兰氏染色Grams-staining阴性(G-)阳性(G+)G+菌落颜色Colorofcolony乳白色

注：“ + ”阳性反应(表示存在或有反应) ,“ - ”阴性反应(表示不存在或无反应)

Note:“ + ”Positive ( show existence or reaction) ， “ -”Negative ( show no existence or no reaction)

表2 FKB-1菌株同源性分析

图5 FKB-1菌株系统发育进化树

3 讨 论

自Baker 等1965 年提出生物防治土传病害以来，关于利用生防菌防治植物生长病害的报道屡见不鲜[17]。相对于食用菌竞争性杂菌绿色木霉菌生物有抑制作用的生防细菌的报道相对较少。实验室从阜康市筛选出一株对绿色木霉病的拮抗菌。通过形态学、16S rDNA 鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。根据抑菌效果推测，解淀粉芽孢杆菌可分泌多种抑菌物质，引致绿色木霉菌菌丝的细胞壁改变结构，增加细胞膜通透性，导致细胞质基质外流，使受抑制的木霉病菌丝无法完成菌丝生长、孢子萌发等代谢过程，最终死亡。

芽孢杆菌作为生防细菌的重要组成部分，解淀粉芽孢杆菌抑菌机理复杂，利用生防菌防治植物病害，不但要考虑生防菌对病原菌的抑制作用，而且还要考虑生防菌在农田生态环境中的生存能力[18]。解淀粉芽孢杆菌在自然界中分布十分广阔。同时能够对多种真菌与细菌产生抑制作用，并且具有丰富的自身代谢产物。 因此在生物防治方面具有广阔的应用前景，可以适当的代替传统的化学农药。同时，随着分子研究技术的提高．解淀粉芽孢杆菌的基因功能更多地被了解，增加可应用的可行性。

4 结 论

采自阜康市棉籽壳基料中，利用对峙平板法筛选出的一株对木霉病有拮抗作用的芽孢杆菌FKB-1菌株。通过形态学鉴定与主要生理生化指标测定结合16S rDNA检测，该菌株菌落为圆形，乳白色，表面初始光泽，几天后变为褶皱，通过革兰氏染色验证为革兰氏阳性，菌体呈现椭圆形，两端紫色，中间较透明。扩增的16S rDNA序列全长1 190 bp，同源性比对认为解淀粉芽孢杆菌。抑菌圈法的结果显示，其对绿色木霉菌的抑菌率为57%，镜检菌丝可以观察到受抑制的菌丝出现弯曲、褶皱、断裂、畸形等现象，且没有孢子囊和孢子束。因细胞膜通透性的增加，细胞质基质外流，使菌丝明显变细，并影响染色效果。证明其有良好的抑菌效果。

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Fund project:Supported by The Construction Project of Science and Technology Infrastructure in Xinjiang Uygur Autonomous Region "The wild Germplasm Resources and Genetic Diversity of Pleurotus Preservation Research Platform Construction" (PT1505)and Special Funds for National Modern Agriculture Industry Technology System Construction (CARS-24)

Screening Identification of Bacillus amyloliquefaciens Resisting to Trichoderma Viride

Nuerziya1, GUAN Jian-hua2, JIA Pei-song1, WEI Peng1, LUO Ying1,JIA Wen-jie1, HAO Jing-zhe1 ,3

(1.Key Laboratory of Integrated Management of Harmful Crop Vermin in China North-western Oasis, MinistryofAgriculture,P.R.China/ResearchInstituteofPlantProtection，XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China；2.QingheCountyAgriculturalTechnologyExtensionStation,QingheXinjiang836200，China; 3.CollegeofBiologicalSciences，ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

【Objective】 In order to study the bio-control bacteria FKB-1 screened from cottonseed hull of the Experimental Station of edible fungus in Fukang City. Morphological and 16S rDNA sequence alignment were used to identify its species.【Method】he plate-confrontation method and antibacterial circle method were used for preliminary screening and antimicrobial testing in vitro, respectively. Meanwhile, we identified its species by physiological and biochemical characteristics, as well as 16S rDNA gene sequence alignment.【Result】FKB-1 showed a stable inhibitory effect againstTrichodermavirideand inhibition zone diameter was 57%. This bacterium was identified asBacillusamyloliquefaciens.【Conclusion】FKB-1 was a kind of bacillus amyloliquefaciens with bio-control to Trichoderma viride.

Bacillusamyloliquefaciens;Trichodermaviride; inhibition effect; physiological and biochemical characteristics

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.07.017

2016-03-15

野生阿魏菇种质资源保藏与遗传多样性研究平台建设(PT1505)；国家现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-24)

努尔孜亚(1977-)，女，新疆伊犁人，助理研究员，研究方向为阿魏菇种质资源保藏与病虫害防控，(E-mail)823037554@qq.com

郝敬喆(1970-)，男，新疆乌鲁木齐人，副研究员，研究方向为设施食用菌栽培病虫害防控，(E-mail)urmqhjz@163.com

S182

A

1001-4330(2016)07-1297-06